巨噬細胞是免疫系統中的重要細胞類型，也是單核吞噬系統的重要組成部分，參與免疫系統調節、病原體清除、傷口愈合和血管生成等。臨床前研究表明，骨髓來源的巨噬細胞（Bone Marrow Derived Macrophage，BMDM)的注射能夠減輕炎癥、消除纖維化并促進肝組織再生[1,2]，而今年在Nature Medicine發表的研究成果“Autologous macrophage therapy for liver cirrhosis: a phase 2 open-label randomized controlled trial”也進一步表明巨噬細胞可以通過釋放抗纖維因子和促進肝細胞再生來進行肝硬化治療，擁有顯著的治療優勢[3]。
在體外培養過程中，巨噬細胞具有高度的可塑性，能夠根據微環境的不同極化為不同的表型。在各種細胞因子的刺激下，未分化的巨噬細胞（M0）主要極化為兩種表型：M1型（促炎，經典活化）和M2型（抑炎，替代活化）。
圖1 不同刺激下的巨噬細胞表型[4]
BMDM培養實驗步驟[5-7]
小鼠骨髓細胞提取
01 小鼠(6~8周)頸椎脫臼法處死，將處死的小鼠迅速放入含有75%酒精的小燒杯中浸泡2min。
注：BMDM受污染后，培養時會變得不粘附，因此暴露骨髓前應確保乙醇徹底浸泡小鼠
02 在超凈臺中，手術取出所有的脛骨和股骨，并用剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈；
注：BMDM接種培養后匯合度能達到75%，如果細胞較稀少，可能是由于切割股骨和脛骨邊緣過多導致收集的骨髓量不足，每次應切割骨邊緣0.5毫米，以減少損失。
03 將取好的骨頭轉移到裝有無菌PBS的培養皿中，涮洗一次后轉移至另一個裝有無菌PBS的培養皿；
04 用剪刀剪去骨的兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別插入兩端骨髓腔中，用注射器打入PBS，反復沖洗骨髓至培養皿中，直至骨頭完全變白；
注：分離過程應全程在冰上操作，保持低溫環境
05 收集骨髓懸液，用70um篩網過濾去除小碎片和肌肉組織；將濾過液500g，5 min離心，棄去上清；
06 將離心后的沉淀吹散，用ACK緩沖液去除紅細胞，200g、5min離心，棄去上清。
07 將細胞以5×105個cells/mL接種在含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素和10ng/mL M-CSF(Cat#CB34）的DMEM培養基中進行培養。
巨噬細胞極化誘導
隔天半量換液，給細胞補充新鮮的含細胞因子M-CSF的培養基。誘導分化6-7天，細胞分化成M0。
注：大概3天后，骨髓細胞培養物開始呈現良好狀態，形成了分裂細胞簇，此時已經可以觀察到最初的貼壁細胞
M1方向極化
分化6-7天后，在Mouse M-CSF存在的情況下，繼續加入100ng/ml的LPS和50ng/ml的Mouse IFN-γ（Cat#C746），極化24-48小時；
M2方向極化
分化6-7天后，在Mouse M-CSF存在的情況下，繼續加入10ng/ml的Mouse IL-4（Cat#CK15)和（或）10ng/ml的Mouse IL-13（Cat#CX57)，極化24-48小時。
巨噬細胞鑒定
M0型：流式檢測，選擇F4/80+和CD11b+雙陽表達作為鑒定巨噬細胞成熟的標志蛋白；
M1型：流式檢測，M1巨噬細胞上調表達CD86、MHCⅡ、CD11c等；
M2型：流式檢測，M2巨噬細胞上調表達CD20等；
近岸蛋白可提供科研級M-CSF、IFN gamma、IL-4、IL-10、IL-13等細胞因子產品，高活性、低內毒素、高批間一致性，助力體外巨噬細胞培養。
產品驗證數據
Recombinant Mouse M-CSF （167篇文獻引用）
Measured in a cell proliferation assay using M?NFS?60 mouse myelogenous leukemia lymphoblast cells.The ED50 for this effect is 0.04-0.2 ng/ml.
Recombinant Mouse IFN gamma
Determined by its ability to inhibit the proliferation of murine WEHI-279 cells. The expected ED50 is 1 ng/ml.
Recombinant Mouse IL-4
Measured in a cell proliferation assay using NFS?60 mouse myelogenous leukemia lymphoblast cells.The ED50 for this effect is 182 pg/mL.
Recombinant Mouse IL-13
Measured in a cell proliferation assay using TF?1 human erythroleukemic cells. The ED50 for this effect is 2-13 ng/ml.
參考文獻
[1]Bird, T. G. et al. Bone marrow injection stimulates hepatic ductular reactions in the absence of injury via macrophage-mediated TWEAK signaling. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 6542–6547 (2013).
[2]Thomas, J. A. et al. Macrophage therapy for murine liver fibrosis recruits host effector cells improving fibrosis, regeneration, and function. Hepatology 53, 2003–2015 (2011).
[3]Brennan, Paul N et al. Autologous macrophage therapy for liver cirrhosis: a phase 2 open-label randomized controlled trial.Nature medicine vol. 31,3 (2025)
[4]Gao, Jing et al. Shaping Polarization Of Tumor-Associated Macrophages In Cancer Immunotherapy.Frontiers in immunology vol. 13 888713. 30 Jun. 2022.
[5]Song, Jin-Qian et al. Discovery of Balasubramide Derivative with Tissue-Specific Anti-Inflammatory Activity Against Acute Lung Injury by Targeting VDAC1.”Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) vol. 11,48 (2024)
[6]Ying W, Cheruku PS, Bazer FW, Safe SH, Zhou B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. 2013
[7]Delprat V, Tellier C, Demazy C, Raes M, Feron O, Michiels C. Cycling hypoxia promotes a pro-inflammatory phenotype in macrophages via JNK/p65 signaling pathway. Sci Rep. 2020