英文標題：Metabolic signaling of ceramides through the FPR2 receptor inhibits adipocyte thermogenesis

中文標題：神經酰胺通過FPR2介導的代謝信號傳導抑制脂肪細胞產熱

發表期刊：Science

影響因子：44.7

神經酰胺是鞘磷脂代謝關鍵產物，與多種代謝疾病密切相關，但其作為系統信號分子的體內作用機制尚不明晰。脂肪細胞產熱對維持機體能量平衡和體溫穩態至關重要，cAMP信號通路參與其中，G蛋白偶聯受體(GPCRs)在調控脂肪細胞產熱中起核心作用。目前，雖已深入研究GPCRs對脂肪細胞產熱的調控，但神經酰胺與GPCRs的交互關系及對脂肪細胞產熱的調節作用研究較少。本研究聚焦于此，期望揭示相關調控機制，為解析神經酰胺在代謝疾病中的作用機制提供新思路，助力開發代謝疾病創新治療策略。

1、C16:0神經酰胺對脂肪代謝相關功能及FPR2受體信號通路的影響

研究者以C16:0神經酰胺為例，研究神經酰胺是否直接與GPCRs相互作用，啟動跨膜信號傳導，調節棕色和米色脂肪細胞的產熱功能（圖1A）。給正常飲食(NCD)喂養的野生型(WT)小鼠腹腔注射溶劑或C16:0神經酰胺，持續3天。在冷暴露期間，給予外源性C16:0神經酰胺會降低小鼠的耗氧量和能量消耗，但不影響其食物攝入量和運動活性（圖1B-C）。

細胞實驗方面，研究者使用C16:0神經酰胺對棕色脂肪組織(BAT)、皮下白色脂肪組織(scWAT)以及成熟脂肪細胞進行短暫刺激（刺激時長為15分鐘）時，這些組織和細胞內的cAMP含量呈現出明顯的下降趨勢（圖1D），這提示G_i偶聯受體可能參與了神經酰胺對脂肪組織的急性作用。

為進一步探究，研究者借助GSE40486的微陣列數據，篩選出小鼠棕色脂肪組織中高表達的60種GPCRs。后續利用GloSensor-cAMP檢測法對這些受體展開篩選，發現在過表達FPR2的人胚腎293(HEK293)細胞中加入C16:0神經酰胺后，由佛司可林誘導產生的cAMP水平呈劑量依賴性下降（圖1E）。使用G_αi1和G_αi2解離實驗進一步驗證，結果表明人源hFPR2和小鼠源mFPR2這兩種不同物種的GPCRs對其內源配體的反應有時會有所不同（圖1F）。具體而言，C16:0神經酰胺在G_i信號通路中激活hFPR2或mFPR2的效能與其他已知的內源性配體（如fMLFII、Ac2-26、LL-37、humanin）相當，但功效較低，可能是FPR2的部分激動劑。

研究者運用G蛋白解離和β-arrestin1募集實驗，探索原代脂肪細胞內源性FPR2的響應。構建含G蛋白及β-arrestin1 BRET探針的慢病毒感染原代脂肪細胞，并以Adipoq-Cre^+/−Fpr2^fl/fl小鼠作陰性對照。結果顯示，從Fpr2^fl/fl小鼠分離的原代脂肪細胞，其G_i信號通路可被激活，且對C16:0神經酰胺、LL-37和fMLFII呈濃度依賴性反應，而陰性對照的原代脂肪細胞無此反應（圖1G）。

2、FPR2與神經酰胺的直接相互作用

研究者使用FPR2抗體，研究了野生型小鼠的scWAT和BAT中FPR2的表達模式，并以Fpr2基因缺陷型(Sox2-CreER^+/−Fpr2^fl/fl)小鼠作為陰性對照。結果表明，FPR2主要分布在野生型小鼠的scWAT或BAT中表達脂聯素的脂肪細胞內，而在Fpr2基因缺陷型小鼠中則不存在這種分布（圖2A-B）。

為探究C16:0神經酰胺與FPR2的直接結合特性，研究者采用兩種方法，（1）體外實驗：在競爭性結合實驗中，用FITC標記的高親和力肽激動劑WK(FITC)YMVm作用于FPR2。構建含Nanoluc熒光基序且與hFPR2的N端融合的質粒，在HEK293細胞中表達，檢測WK(FITC)YMVm的結合情況。發現C16:0神經酰胺濃度增加時，WK(FITC)YMVm與Nluc-FPR2間的BRET信號減弱；（2）體內實驗：合成125I標記的FPR2肽激動劑125I-Ac2-26。飽和結合分析顯示，其能特異性結合野生型小鼠BAT、scWAT及過表達hFPR2的HEK293細胞的膜組分。競爭性結合實驗證實，C16:0神經酰胺可與125I-Ac2-26競爭結合上述膜組分（圖2C）。

已知GPCR結合會使細胞外結構域發生選擇性構象變化，為探究FPR2是否如此，研究者構建FlAsH BRET傳感器，監測其細胞外環(ECL)區域在結合神經酰胺和fMLFII時的構象變化（圖2D）。結果顯示，C16:0神經酰胺使FPR2的N端靠近ECL1和ECL2區域，而fMLFII則使FPR2的N端遠離ECL2區域（圖2E）。這表明C16:0神經酰胺與FPR2結合會引發受體特定細胞外構象變化，可能影響其信號傳導特異性。

3、FPR2介導C16:0神經酰胺對產熱的抑制作用

為探究C16:0神經酰胺對冷誘導產熱的抑制是否依賴脂肪細胞FPR2表達，研究者構建了Ucp1-Cre^+/-Fpr2^fl/fl小鼠及Adipoq-Cre^+/-Fpr2^fl/fl小鼠。對兩類基因編輯小鼠及對照Fpr2^fl/fl小鼠，喂正常飲食，腹腔注射溶劑或C16:0神經酰胺（圖3A）。結果顯示，C16:0神經酰胺可抑制Fpr2^fl/fl小鼠在室溫和寒冷下的能量消耗與耗氧量，但在Adipoq-Cre^+/-Fpr2^fl/fl及Ucp1-Cre^+/-Fpr2^fl/fl小鼠中無此效果（圖3B-C）。

研究者進一步研究了冷暴露后C16:0神經酰胺通過FPR2對脂肪細胞產熱的影響。給喂食正常飲食的Adipoq-Cre^+/-Fpr2^fl/fl小鼠、Ucp1-Cre^+/-Fpr2^fl/fl小鼠以及對照Fpr2^fl/fl小鼠腹腔注射溶劑或C16:0神經酰胺。為探究C16:0神經酰胺對BAT活性和米色脂肪生成的抑制作用是否依賴于FPR2，在冷暴露一天后檢測了小鼠BAT和scWAT中產熱相關基因的相對表達（圖3D）。C16:0神經酰胺處理降低了對照組小鼠的直腸溫度以及腹股溝和肩胛間區域的局部溫度，同時降低了UCP-1蛋白水平和產熱基因的表達（圖3E-F）。H&E染色和免疫組化進一步證實，C16:0神經酰胺處理抑制了Fpr2^fl/fl小鼠的BAT活性和米色脂肪生成（圖3G）。然而，在兩類基因編輯小鼠中，C16:0神經酰胺的上述作用消失了（圖3E-G）。白色脂肪組織中Fpr2基因缺乏可上調UCP-1等產熱相關基因表達，且不依賴外源性C16:0神經酰胺（圖3D-G）。綜上，在生理條件下，內源性神經酰胺可能通過激活FPR2抑制白色脂肪組織向棕色脂肪的轉化及產熱過程（圖3呈現了Adipoq-Cre^+/-Fpr2^fl/fl小鼠在相關實驗中的結果，Ucp1-Cre^+/-Fpr2^fl/fl小鼠的實驗結果詳情可查閱原文的補充材料）。

4、FPR2與神經酰胺復合物的整體結構及識別特異性

神經酰胺的脂肪鏈長度以及特定位置上不飽和的碳碳雙鍵存在差異，會影響其生理功能。因此，研究者探究了各種脂質結構對FPR2的作用活性（圖4A-B）。神經酰胺的亞結構，如棕櫚酸(PA)、花生酸(AA)和鞘氨醇，不能激活FPR2下游的G_i信號通路（圖4B）。只有具有飽和脂肪鏈（C2:0、C6:0、C10:0、C16:0、C18:0和C20:0）的神經酰胺才能激活FPR2（圖4B）。帶有不飽和碳碳雙鍵（C18:1和C24:1）的神經酰胺以及超長鏈神經酰胺無法激活FPR2（圖4B）。

為了剖析飽和長鏈神經酰胺是如何被膜受體FPR2特異性識別的，研究者使用單顆粒冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)來確定與神經酰胺和G_i1形成復合物的人類FPR2的結構，重構、純化了C16:0、C18:0和C20:0神經酰胺-FPR2-G_i1-scFv16復合物（圖4C）。神經酰胺呈 “p” 形垂直插入FPR2正構結合位點，與fMLFII和humanin結合方式相似，區別于與Gq偶聯的神經酰胺受體CYSLTR2（圖4D）。

5、神經酰胺在FPR2正構位點的結合

在C16:0、C18:0和C20:0神經酰胺-FPR2-G_i1復合物結構中，神經酰胺由C18鞘氨醇鏈與N-?；溄浿行孽０锋I連接，其鞘氨醇脂肪鏈深入FPR2配體口袋，與特定芳香殘基作用并占據fMLFII位置（圖4D）。脂肪鏈位于由L109³^.³?、F110³^.³?、R201?^.³?、R205?^.?²和F257?^.?¹組成的口袋中（圖5A-D）。L109³^.³?A、F110³^.³?A、R201?^.³?A、R205?^.?²A和F257?^.?¹A的突變會降低神經酰胺誘導的FPR2激活（圖5F）。特別是，H102³^.²?和F178^ECL2可能與神經酰胺的不飽和C=C雙鍵形成長距離的π-π堆積（圖5A-D）。H102³^.²?L/A或 F178^ECL2L/A的突變顯著降低了這些神經酰胺誘導的FPR2激活（圖5F）。脂肪酸部分脂肪鏈折疊成特定結構，圍繞其疏水口袋殘基突變會損害FPR2對神經酰胺刺激的激活，表明FPR2細胞外疏水環境有助于結合（圖5F）。由于FPR2的配體口袋較大，且神經酰胺的脂肪鏈具有柔性，研究者進行了分子動力學模擬，以研究在冷凍電鏡結構中未觀察到的潛在相互作用。發現E89^ECL1等殘基與神經酰胺中心羧化鞘氨醇基團相互作用（圖5E）。這些殘基的丙氨酸突變降低了FPR2對神經酰胺刺激的激活（圖5F）。

6、FPR2對神經酰胺識別特異性的調控機制

在C16:0（p構象）、C18:0（s構象）及C20:0（s構象）神經酰胺與FPR2相關復合物結構中，神經酰胺脂肪酸部分呈彎曲構型（圖4C和圖5A-C），而脂肪酸鏈中C=C雙鍵的存在可能會破壞此構型，致不飽和神經酰胺無法與FPR2穩定互作（圖6C-D）。飽和Cn:0神經酰胺活性隨脂肪酸碳鏈增長而增強，達22個碳原子時活性消失（圖4A-B）。在相關復合物中，神經酰胺脂肪酸脂肪鏈被跨膜結構域5(TM5)、ECL2和ECL3細胞外疏水殘基包圍（圖6A），碳鏈增長可增加與FPR2疏水作用（圖6B）。這些殘基突變對C18:0、C20:0誘導的FPR2激活影響大于C16:0，表明FPR2區域疏水口袋可塑性對容納長鏈神經酰胺很重要，且計算模擬顯示該口袋對極長鏈神經酰胺而言可能過小（圖6E）。

7、神經酰胺對FPR2及其相關受體的選擇性作用

為探究神經酰胺信號傳導特異性，研究者測試了C16:0神經酰胺對6種與FPR2密切相關的GPCR（FPR3、FPR1、GPR32、C5R1、CMKLR1和GPR1）的活性影響。結果顯示，這些受體對C16:0神經酰胺均無響應（圖7A-B）。其中，FPR1和FPR3與FPR2親緣關系最近（圖7C），但FPR2中識別羧化鞘氨醇基團或不飽和C=C的關鍵殘基，如E89^ECL1、D281?^.³²和H102³^.²?，在FPR1中被替換（圖7C-D），相應突變降低了神經酰胺對FPR2的激活，致使神經酰胺無法激活FPR1（圖7F）。FPR3中L198?^.³?、R201?^.³?和R205?^.?²發生替換（圖7C和E），FPR2中對應突變也降低C16:0神經酰胺的激活作用（圖7F）。除FPR成員外，其他進化上接近FPR2的受體無“E^ECL1&H³^.²?”基序，FPR2相應突變損害C16:0神經酰胺誘導的G_i活性（圖7C和F）。相反，FPR1的G89^ECL1E突變和 FPR3的A198?^.³?L-H205?^.?²R組合突變，使這兩種受體能夠感知C16:0神經酰胺（圖7G-J）。以上結果確定E89^ECL1、L198?^.³?和R205?^.?²為識別神經酰胺的關鍵決定因素。

8、神經酰胺激活FPR2的潛在機制

為了探究神經酰胺激活FPR2的機制，研究者基于AlphaFold蛋白質結構數據庫預測結構，在脂雙層中進行分子動力學松弛處理后，構建了無配體FPR2模型（圖8A-B）。通過對比神經酰胺-FPR2-G_i復合物的冷凍電鏡結構與該模型，發現關鍵構象變化（圖8C-G）。C16:0神經酰胺的鞘氨醇脂肪鏈與特定殘基相互作用，引發殘基旋轉、移動，促使作為轉換開關的W254?^.??與保守基序堆積，使神經酰胺結合誘導的構象變化經轉換開關傳至相關基序及細胞質區域（圖8E）。這一過程中，無配體FPR2結構中的特定鹽橋和氫鍵被破壞，新的極性相互作用網絡形成（圖8F）。同時，C16:0-FPR2-G_i結構中，FPR2的TM7向外移動，引發相關基序重排，特定殘基間形成額外的π-π堆積和π-陽離子堆積（圖8G）。

神經酰胺作為鞘磷脂代謝核心分子，其異常累積與糖尿病、肥胖及動脈粥樣硬化等代謝疾病密切相關。近期研究發現，C16:0神經酰胺可以直接與脂肪細胞中的神經酰胺膜受體FPR2結合，激活G_i信號通路，降低細胞內cAMP水平，進而抑制UCP-1表達，降低產熱能力，基因敲除或拮抗劑實驗已證實FPR2的介導作用。研究團隊利用冷凍電鏡解析神經酰胺-FPR2-G_i復合物結構，揭示FPR2對神經酰胺的選擇性識別機制。該研究成果為深入剖析神經酰胺的生理功能打開了全新的窗口，為代謝性疾病靶向治療開拓了新方向。