【答疑解惑】類器官培養100問-血管共培養篇
類器官是由成體干細胞或多能干細胞誘導分化并經體外3D環境培養的細胞團，具備主要組織或器官的三維結構與生理功能。然而，大部分的類器官缺乏血管網絡的支持，這限制了其形態大小和發育狀態，導致無法完全模擬人體內真實的組織器官。血管化問題是在類器官研究領域中的一個重要挑戰。
血管化類器官構建的主要挑戰在于如何有效地形成和維持血管網絡，以確保類器官內部細胞的營養供應和代謝廢物排出。血管化過程涉及復雜的生物學機制，包括血管發生和血管生成等，這些過程需要精確的調控和適當的培養條件。其中，類器官/血管共培養是實現類器官血管化的一種重要方法。為此，小編針對類器官/血管共培養體系的細胞來源、培養方式、培養條件的優化、共培后類器官的功能鑒定及定位等常見問題進行了匯總整理，歡迎感興趣的老師一起交流討論！
Q1：為了彌補單一類器官在應用上的不足，目前我們可以選擇哪些共培養模型？
A1：
1、免疫微環境共培養（包括T、NK、CAF等免疫微環境中的各類細胞）；
2、血管共培養；
3、間充質細胞共培養；
4、神經網絡共培養；
5、不同種類的類器官共培養；
6、作為感染模型共培養（如：病毒、細菌等共培養）。
Q2：當我們需要做體外類器官血管化培養時，可以選用哪些來源的細胞作為類器官中“血管”的部分？
A2：
1、內皮細胞。Takebe等人【1】將iPSC衍生的肝內胚層、人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）和人骨髓間充質干細胞（MSCs）接種在Matrigel中，培育出了血管化的肝芽（LBs）；
2、干細胞。如：iPSC、ESC可以分化為血管內皮細胞或血管類器官；
3、類器官共分化。通過誘導人多能干細胞同時向血管譜系和特定類器官譜系分化，以產生具有血管樣結構的類器官【2】。
Q3：類器官與血管共培養有哪些方面的應用？
A3：
1、血管系統發揮著運輸營養物質、氧氣、代謝廢物等重要作用，在缺乏可灌注的血管系統模型中，類器官僅依靠被動擴散來交換營養物質、氧氣和代謝廢物，如果尺寸過大，會逐漸導致類器官的核心壞死【3】；
2、使用這些血管類器官來模擬疾病進程中的血管病變。如：通過構建干細胞誘導分化（iPSC）的血管類器官模型，可以用于阿爾茨海默病、心血管疾病、傷口愈合、中風、癌癥和糖尿病等一系列血管相關疾病的病因和治療方法研究【4】；
3、作為抑制血管生成藥物的效果評價模型。如：靶向血管內皮生長因子/血管內皮生長因子受體的藥物正在用于治療耐藥和轉移性結直腸癌的研究【5】；
4、作為特定的研究模型。如：血管類器官（BVOs）可以重現發育過程中血管的結構和功能，并且BVOs浸潤腦類器官從而形成血腦屏障（BBB）模型【6】。
Q4：類器官的血管共培養有哪些方式？
A4：
1、使用內皮細胞包裹類器官共培養。如：將人內皮細胞嵌入基質膠中，并在其中添加早期類器官(如圖1）。隨著時間的流逝，這會導致人類內皮細胞自組裝成類器官外圍的毛細血管并侵入形成血管網絡。當然這種方式可以在類器官的外圍形成明顯的血管網絡，但在類器官中心的血管網絡形成較少【7】；
圖1. 內皮細胞包裹類器官共培養流程示意圖【7】
2、干細胞與血管內皮細胞均勻混合后共培養。如：將hESCs或iPSCs與人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)共培養，定向誘導其分化為血管化的腦類器官（如圖2）。免疫熒光染色結果表明，HUVECs在腦類器官中相互連接，并形成具有通透能力的復雜血管系統，該血管系統可以在腦類器官中可穩定存在200天以上【8】；
圖2. 干細胞與血管內皮細胞均勻混合后共培養流程示意圖【7】
3、誘導自發血管化。如：通過動態調節WNT信號通路，控制近端腎小球和遠端腎小管的比例，調節近端足細胞釋放血管內皮生長因子A(VEGFA)的水平，進而可誘導血管化的腎臟類器官分化形成【9】；
4、移植到體內形成血管結構。如：在體外將人胚胎干細胞(hESC)誘導分化為腦類器官后，直接移植入免疫缺陷小鼠軟腦膜血管上。移植的類器官繼續進行分化和成熟，并與小鼠腦組織進行了很好的整合，雙光子掃描成像結果顯示小鼠血管侵入移植物并生長延伸，血管內血流活躍，移植物類器官功能性血管網絡發展良好【10】。
Q5：有哪些細胞因子/小分子可以促使干細胞向血管分化？
A5：干細胞在分化過程中，受不同的信號通路調控。那么激活/抑制特定的通路就要通過添加不同的細胞因子/小分子來實現。
下表總結了血管分化途徑中所需的細胞因子/小分子，以及在分化過程中行使的功能【11】。
表1. 血管類器官培養中所需的細胞因子和小分子【11】
Q6：血管化后的類器官有哪些可檢測的特征和功能？
A6：
1、具有血管的一些表型特征，如：在含有凝膠的3D培養體系下，血管內皮細胞可以自發形成血管網絡；能夠表達內皮細胞（CD31）、周細胞（PDGFR-β）、血管基底膜（Col IV）等相應的血管特征標志物（如圖3）；
圖3. 從人多能干細胞分化出來的血管網絡，和血管類器官的特征標志物【12】
2、能夠分泌多種因子，調節目的細胞的發育成熟，如：與單獨培養的腦類器官相比，血管化的腦類器官中神經元更成熟【8】；
3、具有一定的可灌注功能，如：向血管化的類器官中灌注FITC-葡聚糖，通過檢測類器官內部的FITC信號，確定血管是否具有可灌注的功能【13】；
4、與未血管化的類器官相比，能夠更好地維持類器官的長時間生長，凋亡信號更低【14】；
5、與某些類器官共培養時能夠執行功能，如：與腦類器官共培養可以形成血腦屏障；
6、在體內移植類器官過程中，血管系統可以募集宿主ECs來重建功能性血管系統，并促進血液流入移植物，提高移植物的存活率【8】；
Q7：在類器官血管化的模型中，如何有效地定位血管？
A7：
1、如果需要實時觀察血管的生成情況，可以將內皮細胞預先進行熒光標記，在培養過程中可以在熒光顯微鏡下觀察血管結構【15】；
2、由于內皮細胞在凝膠培養體系中易成管，因此可以在培養過程中使用熒光標記的液體灌注，在熒光顯微鏡下可以觀察到清晰的血管結構【16】；
3、可以將培養物固定后，通過免疫熒光鑒定出血管內皮細胞的位置。
Q8：和單一類器官培養體系相比，類器官-血管這種共培養的體系需要如何調整？
A8：通常是兩種培養基按照1：1（v/v）混合，便于維持兩種模型的生長。當然這并不一定是最優的培養體系，如果有需要可以進行不同配比和其他體系的優化。
Q9：不同組織的血管化模型是一致的嗎？
A9：不是的，由于身體的每個組織都有自己獨特的結構、細胞組成和功能，那么我們構建的血管化類器官也要匹配對應組織的特性，這些差異主要包括不同的血管網絡結構、內皮細胞表型等特征。例如：肌肉、脂肪或血腦屏障等組織中的ECs可以是“連續的”，細胞與細胞之間緊密地連接在一起，限制了通透性；而在一些內分泌組織中，ECs可以是“不連續的”，細胞之間有間隙，可以允許更大的分子進行交換【17】。
Q10：可以實現不同類型的類器官共培養嗎？
A10：已有研究通過將肝臟和胰島類器官進行共培養，構建了2型糖尿?。═2DM）疾病模型（如圖4）【18】，這種多類器官系統可以在生理和病理條件下體外模擬肝-胰島軸，為今后 T2DM 發病機制研究和藥物開發提供了獨特的研究平臺。
圖4. 在微孔設備中共培養肝臟和胰島類器官【18】
Takebe等人利用hPSC的三維分化方法產生多內胚層結構域，在前腸-中腸邊界形成了視黃酸依賴的肝膽胰臟器官結構，在體外實現了人肝-膽-胰（hepato-biliary-pancreatic, HBP）類器官的共培養【19】。
圖5. hPSC誘導分化為HBP類器官的原理圖【19】
近岸蛋白依靠專業的研發團隊，精心打造類器官驗證平臺，致力于為廣大類器官客戶提供經驗證、高活性、可信任的類器官培養產品。近岸蛋白可提供自主研發生產的30余種類器官培養相關細胞因子，如Activin A、BMP-4、Wnt3a、R-Spondin、Noggin、EGF、FGFs等高活性、高穩定性細胞因子，以及一系列類器官培養基，涵蓋腸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌等腫瘤類器官以及正常肝/肺類器官完全培養基，經過類器官培養驗證，專為類器官培養開發，產品適用性高，已廣泛應用于企業和科研院所，讓您的類器官培養更可控!
類器官培養細胞因子產品
|
類器官培養類型 |
相關因子 |
|
胃類器官 |
Activin A、BMP-4、EGF、FGF-4、FGF-10、Noggin、 R-spondin 1、Wnt3a
|
|
腸類器官 |
Activin A、BMP-4、EGF、FGF-4、Noggin、R-spondin 1、Wnt3a |
|
肝類器官 |
Activin A、BMP-4、BMP-7、FGF-7、FGF-10、FGF-19、HGF、OSM、R-Spondin 1 |
|
肺類器官 |
Activin A、FGF-4、FGF-7、FGF-10、Noggin、SHH、Wnt3a |
|
前列腺類器官 |
EGF、FGF-10、Noggin、R-spondin 1、Wnt-3a |
|
腦類器官 |
BDNF、EGF、FGF basic、GDNF、NT-3 |
|
內耳類器官 |
BMP-4、FGF basic |
|
視網膜類器官 |
SHH、Wnt-3a |
|
乳腺類器官 |
EGF、FGF basic、FGF-7、FGF-10、Heregulinβ-1、Noggin、R-Spondin 1、R-Spondin 3、Wnt-3a |
|
腎臟類器官 |
BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF basic、FGF-9、Activin A、FGF-7、GDNF、R-Spondin 1 |
|
心臟類器官 |
Activin A、BMP-4、FGF basic、TGF-beta 1、Transferrin |
|
血管類器官 |
BMP-4、FGF basic、VEGF |
類器官培養基產品
|
目錄號 |
產品名稱 |
|
OCMHC01 |
Intestinal Cancer（腸癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC02 |
Renal Cancer（腎癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC03 |
Brain Glioma（腦膠質瘤）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC04 |
Liver Cancer（肝癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC05 |
Lung Cancer（肺癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC06 |
Breast Cancer（乳腺癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC07 |
Gastric Cancer（胃癌） Organoid Culture Medium |
|
OCMHC08 |
Pancreatic Cancer（胰腺癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC09 |
Esophageal cancer（食管癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC10 |
Cervical carcinoma（宮頸癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMHC11 |
Thyroid carcinoma（甲狀腺癌） Organoid Culture Medium |
|
OCMHC12 |
Prostatic cancer（前列腺癌） Organoid Culture Medium |
|
OCMHC13 |
Bladder Cancer（膀胱癌） Organoid Culture Medium |
|
OCMHC14 |
Ovarian Cancer （卵巢癌）Organoid Culture Medium |
|
OCMMN01 |
Mouse Intestinal （小鼠小腸）Organoid Culture Medium |
|
OCMMN02 |
Mouse Colonic （小鼠結腸）Organoid Culture Medium |
|
OCMHN01 |
Liver Organoid （肝擴增）Expansion Medium |
|
OCMHN02 |
Liver Organoid （肝分化） Differentiation Medium |
|
OCMHN03 |
Lung Organoid （肺擴增） Culture Medium |
參考文獻
【1】Takebe, T. et al. (2013). Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature, 499(7459), 481-484.
【2】Cui, K. et al. (2023). Engineering placenta‐like organoids containing endogenous vascular cells from human‐induced pluripotent stem cells. Bioengineering & Translational Medicine, 8(1), e10390.
【3】Pham, M. T. et al. (2018). Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport, 29(7), 588-593.
【4】Wimmer, R. A. et al. (2019). Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature, 565(7740), 505-510.
【5】Al Bitar, S. et al. (2023). Molecular mechanisms targeting drug-resistance and metastasis in colorectal cancer: Updates and beyond. World Journal of Gastroenterology, 29(9), 1395.
【6】Ahn, Y. et al. (2021). Human blood vessel organoids penetrate human cerebral organoids and form a vessel-like system. Cells, 10(8), 2036.
【7】Wörsdörfer, P. et al. (2019). Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Scientific reports, 9(1), 15663.
【8】Shi, Y. et al. (2020). Vascularized human cortical organoids (vOrganoids) model cortical development in vivo. PLoS biology, 18(5), e3000705.
【9】Low, J. H. et al. (2019). Generation of human PSC-derived kidney organoids with patterned nephron segments and a de novo vascular network. Cell stem cell, 25(3), 373-387.
【10】Mansour, A. A. et al. (2018). An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature biotechnology, 36(5), 432-441.
【11】Yu, J. (2021). Vascularized organoids: a more complete model. International Journal of Stem Cells, 14(2), 127.
【12】Wimmer, R. A. et al. (2019). Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature protocols, 14(11), 3082-3100.
【13】Frenkel, N. et al. (2021). Long-lived human lymphatic endothelial cells to study lymphatic biology and Lymphatic Vessel/Tumor Coculture in a 3D Microfluidic Model. ACS Biomaterials Science & Engineering, 7(7), 3030-3042.
【14】Cakir, B. et al. (2019). Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nature methods, 16(11), 1169-1175.
【15】Rajasekar, S. et al. (2020). IFlowPlate—A customized 384‐well plate for the culture of perfusable vascularized colon organoids. Advanced materials, 32(46), 2002974.
【16】Bonanini, F. et al. (2022). In vitro grafting of hepatic spheroids and organoids on a microfluidic vascular bed. Angiogenesis, 25(4), 455-470.
【17】Strobel, H. A. et al. (2023). Vascularized tissue organoids. Bioengineering, 10(2), 124.
【18】Tao, T. et al. (2022). Microengineered multi‐organoid system from hiPSCs to recapitulate human liver‐islet axis in normal and type 2 diabetes. Advanced Science, 9(5), 2103495.
【19】Koike, H., et al. (2019). Modelling human hepato-biliary-pancreatic organogenesis from the foregut–midgut boundary. Nature, 574(7776), 112-116.