英文題目：Integrated physiological, transcriptomic and metabolomic analyses reveal ROS regulatory mechanisms in two castor bean varieties under alkaline stress

中文題目：綜合生理學、轉錄組學和代謝組學分析揭示了堿脅迫下兩個蓖麻品種的ROS調節機制

發表期刊：Plant Physiology and Biochemistry

影響因子：6.1

作者單位：沈陽農業大學

百趣提供服務：新一代代謝組學NGM2、轉錄組學

鹽堿脅迫是農業和環境領域的主要挑戰之一，其對植物生長的抑制作用和環境惡化已成為全球關注的問題。在全球氣候變化和土地退化的背景下，蓖麻的種植潛力和價值越來越受到關注，迄今為止，已有大量研究調查了抗逆性蓖麻對各種脅迫的反應，包括鹽堿條件、重金屬、溫度和干旱等。然而，堿脅迫下蓖麻的ROS（活性氧）信號響應機制尚未見報道。在這種背景下，本研究采用堿敏感的淄蓖8號(ZB8)和耐堿的稼祥22號(JX22)品種來闡明耐堿蓖麻品種的氧化脅迫反應機制。

在堿脅迫下，蓖麻品種JX22(SA22)和ZB8(SA8)形態差異明顯。ZB8萎蔫更嚴重，根長顯著縮短，根H?O?、MDA含量增加幅度更大，O??含量顯著上升。而JX22根長不受影響，O??含量無顯著變化，且抗氧化酶活性更高，能更有效清除ROS（圖1）。這些結果表明，JX22表現出更優越的抗氧化能力，這在減輕ROS誘導的氧化損傷以及增強其對堿性脅迫的耐受性方面發揮了關鍵作用。

主成分分析(PCA)顯示數據有清晰聚類模式，表明轉錄組數據適用于下游分析。鑒定出12264個差異表達基因(DEGs)。KEGG富集分析發現所有對照組的DEGs參與140條途徑，其中CK8與CK22比較中，多種次生代謝途徑（類黃酮生物合成和類胡蘿卜素生物合成等）顯著富集，這些途徑差異可能是蓖麻品種堿脅迫耐受性不同的關鍵因素（圖2）。類似地，對四種處理之間的代謝組學數據進行分析，KEGG途徑富集分析表明，在堿性脅迫下，代謝途徑、氨基酸生物合成和輔因子生物合成在兩個對照組中都顯著富集（圖3）。

基于轉錄組數據分析，在JX22和ZB8根中鑒定了100個與ROS產生相關的差異表達基因，與CK處理相比，幾乎所有的編碼基因在兩個品種中的線粒體、內質網以及胞質溶膠中都表現出下調，表明兩個品種的線粒體和內質網中ROS的產生受到顯著抑制（圖4）。?；o酶a氧化酶(ACX)作為產生H?O?的關鍵酶，ACX編碼基因在堿性脅迫下抗性和敏感品種之間表現出不同的表達模式。此外，大多數編碼其他質外體ROS生成氧化酶的基因，如pH依賴的細胞壁過氧化物酶(POX)和脂肪氧化酶(LOX)，在兩個品種的堿性脅迫下都下調。

進一步研究了參與兩種蓖麻品種之間ROS信號轉導的基因（圖5），富含亮氨酸重復受體樣激酶(LRR-RLKs)能介導非生物應激，在本研究中，堿脅迫下所有LRR-RLK編碼基因均呈下調趨勢。同時，兩個蓖麻品種的質膜定位水通道蛋白(PIPs)和Ca²?通道蛋白(MSLs和TPCs)在堿脅迫處理后也一致下調。植物細胞胞質溶膠中有多種氧化還原傳感網絡，如谷胱甘肽過氧化物酶(GPXs）、硫氧還蛋白(TRXs)和谷氧還蛋白(GRXs），可整合ROS信號。研究發現，堿脅迫下兩個品種多數此類傳感器編碼基因顯著下調，但JX22中LOC8288062(GRXC9)表達上調10倍，顯示其ROS感應能力增強，應激反應更快。胞質溶膠還包含眾多信號轉導中樞，能整合ROS信號與其他信號分子以調節細胞信號網絡。研究顯示，堿脅迫下ZB8 中這些信號轉導中心編碼基因顯著下調，而抗性品種JX22受影響較小。這表明JX22能更有效地利用這些激酶整合ROS信號與其他信號分子，進而更好地適應堿脅迫帶來的損傷。

為了闡明堿性脅迫下兩個蓖麻品種的酶促ROS清除機制，作者構建了參與AsA-GSH循環的差異表達基因(DEGs)的途徑熱圖（圖6）。途徑熱圖顯示，與CK處理相比，堿脅迫下兩個品種的AsA-GSH循環中大多數關鍵酶編碼基因顯著下調。然而，LOC8268764 (CAT2)和LOC8259539(SODA)顯示顯著上調。這些基因表達模式與抗氧化酶活性結果一致（圖1f-h）。有趣的是，CAT基因家族中LOC107261240(CAT2)和LOC8268764(CAT2)表達模式相反。通過氨基酸序列比對和結構域分析發現，LOC8268764(CAT2)有獨特的過氧化氫酶活性位點，分解H?O?的能力更強。堿脅迫雖抑制兩個蓖麻品種AsA-GSH循環中的多數過程，但會特別上調LOC8268764(CAT2)和LOC8259539的表達，增強抗氧化酶活性。LOC8268764(CAT2)的獨特活性位點，可能是JX22耐堿能力強的關鍵原因。

基于轉錄組學和代謝組學分析，作者構建了堿脅迫下兩個蓖麻品種類胡蘿卜素生物合成的途徑熱圖（圖7），以進一步研究它們清除ROS的機制。轉錄分析顯示，多數基因在同品種對照與脅迫處理間的表達模式一致，堿脅迫下顯著下調。不過，類胡蘿卜素合成關鍵基因CYP97B2在ZB8中上調、JX22中下調；降解關鍵基因CCD7在ZB8中下調、JX22中上調。在類胡蘿卜素生物合成途徑中，鑒定了四種差異表達的代謝產物：PP-植基、葉黃素、玉米黃質和脫落酸(ABA)。PP-植基作為類胡蘿卜素生物合成途徑中的上游底物，在堿脅迫下在兩個品種中都表現出上調。葉黃素和玉米黃質表現出相同的積累模式，在ZB8中上調，在JX22中下調。ABA在兩個品種堿脅迫下含量都有所下降。

為了驗證RNA-Seq數據的準確性，作者對所有四種處理中隨機選擇的八個DEGs進行了qRT-PCR分析。qRT-PCR結果顯示，在堿脅迫下，CAT2 (LOC8268764)和ACX1在兩個品種中均上調，而PIP-1-2、LRR-RLK和MSL4則下調。CPK10、CPK4和CAT2(LOC107261240)在兩個品種之間表現出不同的表達模式。所有八個DEGs的表達趨勢與RNA-Seq數據一致，證實了RNA-Seq結果的可靠性（圖8）。

本研究綜合生理、轉錄和代謝分析，對比堿脅迫下蓖麻品種ZB8（敏感）和JX22（抗性）的活性氧響應機制。生理層面，JX22憑借更主動的抗氧化系統，激活抗氧化酶降低ROS水平，減輕氧化損傷，展現出更強的耐堿性。轉錄組學和代謝組學分析表明，JX22在堿脅迫下ROS產生能力優異，為信號轉導提供底物，多種蛋白激酶顯著上調協調ROS通訊。此外，JX22具有更有效的酶活性氧清除系統，而ZB8只能通過不太有效的非酶系統如類胡蘿卜素抗氧化劑來減輕氧化損傷。該研究揭示了蓖麻耐堿機制，為理解堿脅迫下ROS穩態提供框架，有助于開發耐堿新品種。