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我們通常所說的Th1、Th2和Th17是指T輔助細胞(嚴格意義上是Th0細胞)在各種生理與病理條件下分化為Th1、Th2和Th17的能力。靜息狀態(即未受任何刺激，如人的正常生理狀態)下，Th0分化為Th1、Th2和Th17的能力非常弱，所以外周血中僅含有極少量的Th1、Th2和Th17細胞，這時我們所能檢測到的IFN-γ、IL-4、IL-17A也微乎其微。而當Th細胞受到外界因素，如刺激素，病原體等刺激，其中Th0即會向Th1、Th2或Th17大量分化，具體分化趨向取決于細胞因子的種類。此時，我們檢測到的IFN-γ、IL-4或IL-17A也較多。實驗中我們檢測的Th1、Th2和Th17實際上是檢測Th細胞對刺激素刺激的反應能力。

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我們通常選用的刺激素為PMA(佛波酯)+ Ionomycin(離子霉素)。

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其中PMA為PKC(蛋白激酶C)的激活物，PKC則可激活下游眾多的蛋白激酶的磷酸化，形成級聯反應，導致許多蛋白的表達，進而引起T細胞的活化。在細胞內，PKC可被DAG(二脂酰甘油)和Ca2+的共同作用而激活，因此在Ionomycin(Ca2+的轉運劑，可將細胞器內的Ca2+轉運至胞漿內)的參與下，T細胞內PKC可被進一步激活。可見，PMA與Ionomycin協同活化T細胞。

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也有人選用其它刺激劑來活化T細胞，如CD3/CD28協同刺激，PHA刺激等。實驗表明，PMA為廣譜性刺激，即T細胞中的各亞群均會被PMA同等激活，而CD3/CD28協同刺激和PHA刺激，則是通過TCR受體的作用，僅對部分T細胞亞群有效。所以可根據實驗的需要來選擇刺激方式。

活化的T細胞可分泌多種細胞因子至細胞外，而流式細胞儀僅能檢測細胞內的抗原，所以應阻斷細胞因子分泌至細胞外。方法為破壞高爾基體(Golgi)，因細胞因子(即各種蛋白)在合成后需經高爾基體的加工和轉運，才能到達細胞膜，然后通過高爾基體膜與細胞膜的融合作用將細胞因子分泌至細胞外。因此破壞高爾基體即可切斷細胞因子的轉運途徑，干擾其分泌。我們通常選用的阻斷劑為BFA或Monensin, 其中BFA的阻斷效果優于Monensin, 但由于前者價格較昂貴，現實驗中多用Monensin來替代BFA.

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另外，實驗過程中涉及到如何正確的選定Th(即T輔助細胞)的問題。Th細胞的表面標志為CD3+CD4+，而當用PMA刺激4小時時，會發現CD4+的細胞明顯減少，甚至消失，這是因為PMA會誘發細胞表面CD4分子被內吞。所以通常的做法是用CD3和CD8反設CD4細胞，即CD3+CD8-的細胞被認為是CD3+CD4+的細胞。(注：PMA對小鼠CD4的影響很小，所以檢測小鼠Th1/Th2/Th17時可用CD4直接設門)。

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詳細實驗步驟：

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1. 標本采集及制備

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A. 血液標本

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用肝素抗凝管采集靜脈血(必須用肝素鈉抗凝, 不可用肝素鋰、EDTA 或枸櫞酸鈉)1-2ml，血液室溫放置，8 小時內必須進行檢測，否則需棄用。

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B. PBMC(外周血單個核細胞)標本

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1) 肝素抗凝管采集靜脈血至少 2ml，采集后4 小時內使用；

2) 加入等體積的 HBSS(Hank 平衡鹽緩沖液， pH7.2-7.4)稀釋血液；

3) 取與稀釋后血液等體積的淋巴細胞分層液(Ficoll 液)加入離心管中；

4) 將稀釋血液小心地加到淋巴細胞分層液上，注意保持兩者界面清晰；

5) 室溫下，2000 r/min，離心20 分鐘；

6) 用毛細吸管輕輕吸出單個核細胞層，加入含有5ml HBSS 的試管中，充分混勻；

7) 1500 r/min，離心10 分鐘，棄上清后，再洗一次；

8) 棄上清，用 RPMI 1640(含10%熱滅活FBS)重懸單個核細胞，用臺酚蘭染色計數活細胞數(應在95％以上)；

9) 調節細胞濃度為 2 x 106 細胞/ml

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2. 需要的試劑方案

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Human Th1/Th2 四色方案

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Mouse Th1/Th2 三色方案

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