書接上文，已經給大家分享了Xenium空間原位分析的技術原理及特點，樣本制備及應用方向，那如何利用這一硬核技術發表高分文章呢？今天小編就對Xenium技術首發的文獻案例進行詳細解析，并以此總結拓展相關的研究思路，期望能給到大家參考和啟發。
今天要分享的是10x Genomics團隊于2022年10月發表的首篇Xenium空間原位分析應用的bioRxiv預印本文章，文章標題：High resolution mapping of the breast cancer tumor microenvironment using integrated single cell, spatial and in situ analysis of FFPE tissue.
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研究背景
乳腺癌具有高度異質性，臨床上通常根據受體類型(例如，HER2+/ER+/PR+)以及侵襲和增殖程度對乳腺癌進行腫瘤分型，但這種分類不足以描述樣本中的異質性。導管原位癌（DCIS）是一種非浸潤性乳腺癌，是局限在導管內的腫瘤上皮細胞，并沒有擴散到導管的周圍。當導管形態被破壞，癌細胞侵入間質時，DCIS可能進展成預后差的浸潤性導管癌。哪些DCIS會成為浸潤性乳腺癌，哪些不會？目前的研究尚不明確。
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研究思路
乳腺癌塊來自乳腺癌患者(II-B期，ER+/PR?/HER2+)乳腺活檢的FFPE樣本，其中包括導管原位癌和浸潤性導管癌。用FFPE樣本的連續切片進行單細胞轉錄組測序（scFFPE）、空間轉錄組測序（Visium）和原位分析（Xenium）。這里使用Xum Human Breast Panel的280個基因和33個附加基因（共313個）作為靶基因，通過Xenium技術對這些靶基因進行亞細胞水平的空間原位檢測。然后對三種技術檢測到的數據進行比較與聯合分析，進而高靈敏度，高特異性，高分辨率地解析了乳腺癌腫瘤的異質性。
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研究結果
1. scFFPE+Xenium聯合高靈敏度解析乳腺癌組織中的細胞組成
首先對scFFPE-seq數據進行非監督聚類和細胞注釋，鑒定到淋巴細胞、巨噬細胞、內皮細胞、DCIS1、DCIS2和侵襲性腫瘤細胞等17種細胞亞群。然后對Xenium數據進行分析，發現了與scFFPE-seq一致的細胞類群。此外，與scFFPE-seq相比，Xenium能夠獲得更多的細胞數量，因此細胞類群的密度要高很多?？傊?span style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; color: #006bff;" data-darkreader-inline-outline="" data-darkreader-inline-color="">該部分結果說明了Xenium技術能夠解析復雜組織中的細胞組成。
接下來，作者使用scFFPE-seq數據確定Xenium數據中三個感興趣區(ROI)：DCIS#1、DCIS#2和invasive ?的細胞組成和比例的差異。結果發現ACTA2+肌上皮細胞在DCIS#2 ROI中富集，在DCIS#1 ROI中較少，在invasive ROI中缺失。而且DCIS#2 ROI比DCIS#1 ROI含有更多侵襲性腫瘤細胞，KRT15+肌上皮細胞也更多，提示DCIS#2 ROI比DCIS#1 ROI更具侵襲性。
最后，作者探究了七種主要細胞類型的marker基因在這三個區域的表達差異。結果發現，在DCIS#1 ROI中腫瘤細胞標記基因MZB1特異性高表達，DCIS#2 ROI顯著高表達基質細胞的標記基因GJB2，invasive ROI中缺少巨噬細胞標記基因MMP12的表達。
2. Visium+Xenium聯合挖掘感興趣區域的完整轉錄組信息
在臨床上，乳腺癌根據雌激素受體(ER/ESR1)、孕激素受體(PR/PGR)和人類表皮生長因子受體2(HER2/ERBB2)的表達進行亞型分類，并根據腫瘤分型結果制定治療策略。該研究中使用的組織樣本被注釋為HER2+/ER+/PR?。Xenium數據顯示組織切片的大部分區域同時表達ERBB2和ESR1轉錄本（HER2/ER雙陽性），或只表達ERBB2轉錄本（HER2陽性）。然而，在脂肪細胞區域內有一個很小的DCIS區域，顯示出ERBB2、ESR1和PGR轉錄本的三陽性表達（HER2+/ER+/PR+）。
在Visium數據中，這個區域只有5-6個spot，因為太少這個區域很容易被忽視。為了從這個三陽性區域獲得完整的轉錄組信息，作者通過插值法可視化了這個三陽性區域內的細胞類型比例。然后對這6個spot與其它spot進行了全轉錄組差異表達分析，篩選到94個差異表達基因。
3. Xenium+H&E染色/免疫熒光染色
Xenium原位分析的另一個強大優勢在于它的流程是非破壞性的，能夠在運行后對同一組織切片進行H&E染色或免疫熒光染色。這一就能獲得同一張組織切片的組織病理學、蛋白表達和基因表達數據，有助于更全面地了解樣本的生物學特征。
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研究結論
該文章同時用scFFPE-seq、Visium和Xenium三種技術對一個乳腺癌FFPE 樣本連續切片進行檢測。作者首先是說明了三種技術的各自優勢，尤其強調了Xenium技術的穩定性，高特異性，高靈敏度及高分辨率。然后三種數據聯合分析，相互印證補充彼此的分析結果，展示出了三種技術的高度互補性。最終三種技術協同作用，共同解析了乳腺癌腫瘤微環境，揭示了細胞異質性，促進了對導管原位癌（DCIS）腫瘤浸潤的全面研究。
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