細胞凋亡通路及其流式檢測原理簡介-其它資料-資訊-生物在線

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細胞凋亡通路及其流式檢測原理簡介

作者:杭州聯科生物技術股份有限公司 2015-12-30T00:00 (訪問量:15840)

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細胞凋亡(apoptosis)指為維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同,細胞凋亡不是一件被動的過程,而是主動過程,它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用,它并不是病理條件下,自體損傷的一種現象,而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。

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細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段:

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接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→進入連續反應過程。由于細胞凋亡啟動階段的不同,其可分為三條主要通路,即線粒體通路、內質網通路、死亡受體通路。

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圖示:中間處在凋亡期的Hela細胞和周圍的非凋亡期細胞

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流式細胞術檢測細胞凋亡原理及產品推薦

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1.PI 單染法

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原理:根據細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發生的特征性改變。這些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態的改變等,其中細胞核的改變最具特征性,主要包括以下幾個方面:

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(1) 細胞核的改變:由于凋亡細胞核的改變,造成各種染色體熒光染料對凋亡細胞 DNA 可染性發生改變。研究表明,用各種染色體熒光染料對經固定的凋亡細胞進行染色,其 DNA 可染性降低。許多學者把這種 DNA 可染性的降低認為是凋亡細胞的標志之一。

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(2) 光散射特性:凋亡細胞形態上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀上,前散射光與細胞的大小有關,而側散射光反映的是光在細胞內的折射作用,與細胞內的顆粒多少有關。在細胞凋亡時,細胞固縮,體積變小,故前散射光降低,這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。

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2.Annexin V-FITC/PI 雙染檢測法

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原理:在正常細胞中,磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側,細胞發生凋亡最早期,膜磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內側翻向外側,這一變化早于細胞皺縮、染色質濃縮、DNA 片斷化和細胞膜的通透性增加等凋亡現象,可能作為免疫系統的識別標志。AnnexinV 是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白,與 PS 有高度親和力,故可通過細胞外側暴露的 PS 與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此 AnnexinV 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將 Annexin V 進行熒光素(FITC)標記,以標記了的 Annexin V 作為熒光探針,利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但凋亡中晚期的細胞和死細胞由于細胞膜通透性的增加,PI 能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將 Annexin V 與 PI 匹配使用,就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來:PI 被排除在活細胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被 FITC 和 PI 結合染色呈現雙陽性(Annexin V+/PI+)。

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