女人与狗锁死了视频大全|霍金死亡过程恐怖视频|无节社团简谱季免费观看|六间房直播大厅|中文字幕欧美另类精品|久久人人玩人妻潮喷内射人人|亚洲国产一区二区三区在线观看

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 熒光顯微鏡
2. 2X SSC
3. 無(wú)DNA酶的RNA酶
4. 抗淬滅劑，如SlowFade? Gold (S36936) 或ProLong? Gold (P36930)抗淬滅劑

1.2 樣品制備

使用適合您樣品的固定步驟。其他染色后，進(jìn)行PI染色。需要注意的是PI復(fù)染需要細(xì)胞膜通透。

1.3 RNA酶處理

若樣品經(jīng)多聚甲醛，甲醛或戊二醛固定，需要經(jīng)RNA酶處理；若樣品經(jīng)甲醇乙酸或丙酮處理，即不需要RNA酶處理。

1.3.1樣品使用2X SSC（0.3 M NaCl，0.03 M 檸檬酸鈉，pH 7.0）短暫平衡。

1.3.2樣品在含100μg/ml 無(wú)DNA酶的RNA酶的 2X SSC 中孵育 20min， 37℃。

1.3.3使用2X SSC潤(rùn)洗樣品三次，每次1min。

1.4 復(fù)染

1.4.1 使用2X SSC 平衡樣品。

1.4.2 使用2X SSC 將1mg/ml（1.5M）PI儲(chǔ)液 1:3000 稀釋為500nM，通常約300μl足夠一個(gè)蓋玻片染色。
使用稀釋后的染液覆蓋細(xì)胞，孵育1-5min。

1.4.3 使用2X SSC潤(rùn)洗樣品幾次。小心吸干玻片上多余的緩沖液，加入適量的抗淬滅劑如Molecular Probes SlowFade? Gold antifade reagent (S36936) 或 ProLong? Gold antifade reagent (P36930)。

1.4.4 使用熒光顯微鏡觀察樣品。

2、復(fù)染懸浮細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 流式細(xì)胞儀
2. PBS
3. 乙醇
4. Tris 染色緩沖液（見步驟2.3.1）

2.2樣本制備

使用適合于樣品的固定方法，或者使用如下步驟。

2.2.1 收集2 × 10^5-1 × 10^6個(gè)細(xì)胞，離心，棄去上清，輕彈管底以用殘余液體重懸細(xì)胞，加入1ml PBS（室溫）。

2.2.2 將細(xì)胞懸液緩慢轉(zhuǎn)移至4ml高速震蕩的無(wú)水乙醇（-20℃）中，孵育5-15min（-20℃）。

2.2.3 離心，棄去乙醇，輕彈管子，加入5ml PBS（室溫），使細(xì)胞水合15min。

2.3復(fù)染

2.3.1 使用染色緩沖液（100 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.1% Nonidet P-40）
1:500稀釋1 mg/mL (1.5 mM)的PI儲(chǔ)液為3 μM溶液，每個(gè)樣品需1ml。

2.3.2 步驟2.2.3的樣品離心，棄去上清，輕彈管底，加入1ml PI溶液，室溫，孵育15min，然后在流式細(xì)胞儀上分析（在染液存在情況下）。如果要使用熒光顯微鏡觀察，需離心，棄去上清，使用新鮮的緩沖液重懸細(xì)胞。取一滴細(xì)胞懸液于玻片，蓋上蓋玻片，使用合適的濾光片觀察。

3、復(fù)染樣品用于染色體熒光原位雜交技術(shù)（以下稱染色體FISH）

3.1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 熒光顯微鏡
2. dH2O
3. PBS
4. RNA酶
5. 抗淬滅劑（可選）

3.2 樣品制備

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟制備樣品（見參考文獻(xiàn)3,4）。在復(fù)染之前，使用去離子水暫短潤(rùn)洗樣品，去除殘余的鹽緩沖液?？諝飧稍?。最后的潤(rùn)洗對(duì)于降低非特異性結(jié)合有很大幫助。

3.3 復(fù)染

3.3.1 使用PBS 1:1000稀釋1 mg/mL (1.5 mM)的PI儲(chǔ)液為1.5μM的染色溶液。吸取300μL的染色溶液直接加入樣品。如果必要，加入終濃度為10μg/ml的Rnase A（新鮮配制）。使用塑料蓋玻片使染液均勻分布。

3.3.2 室溫，避光孵育30min，或者37℃避光孵育（如加入RNase）。

3.3.3 去除蓋玻片，使用PBS或去離子水潤(rùn)洗，洗去未結(jié)合的染料。

3.3.4 用吸水紙小心洗去樣品周圍殘余的液體。蓋上玻璃蓋玻片，石蠟封片。另外，也可以根據(jù)操作手冊(cè)，加入適量的抗淬滅劑。

3.3.5 使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

參考文獻(xiàn)

1. J Mol Biol 13, 269 (1965);

2. Methods Cell Biol 30, 417 (1989);

3. Methods Enzymol 168, 741 (1989);

4. Pardue, M.L. in Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B.D.
Hames and S.J. Higgins, Eds., IRL Press, Oxford, England (1985).