英文標題：Metabolomic and Single-Cell Transcriptomic Analyses Shed Light on Secondary Metabolite Profiling and Potential Developmental Dynamics of Glandular Trichomes in Artemisia argyi
發表期刊：Plant Biotechnology Journal
影響因子：10.5
研究背景
腺毛(Glandular trichome, GTs)作為天然工廠，能合成并積累倍半萜、黃酮類等多種次生代謝物，其中倍半萜因其復雜的結構和廣泛的生物活性尤為關鍵。艾草(Artemisia argyi)作為傳統中醫藥重要材料，廣泛用于艾灸療法，并在端午節等東亞文化中具有驅蚊、祈福等象征意義。盡管基因組和轉錄組研究已揭示其TPS基因家族的擴張及部分候選基因功能，但現有研究多局限于組織水平，單細胞層面的GTs發育與代謝調控機制仍不明。本研究通過整合代謝組學、單細胞轉錄組學和體外酶活性分析，首次解析了艾草GTs的代謝特征與發育動態，明確了其與非GTs的代謝差異，并構建了倍半萜合成的細胞特異性共表達網絡，為藥用植物特化代謝研究提供了新范式。
研究結果
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1、艾草GTs與NGTs的比較代謝組學分析
艾草葉片表面密布GTs和NGTs, 其中，NGTs在葉片腹面的密度高于背面，導致葉片腹面呈灰綠色、背面為綠色（圖1a）。結構上，GTs為多細胞盾形結構，NGTs為T型結構（圖1b），通過優化機械分離技術，實現了高純度、高完整性的GTs與NGTs分離（圖1c）。在代謝物差異上，總計969種差異積累代謝物（DAMs）被鑒定（圖1d-e），其中GTs中富集的代謝物占比遠高于NGTs。聚焦DAMs，可以發現，萜類化合物是GTs中最主要的代謝物類別，倍半萜尤為突出（圖1e-f）；類黃酮在GTs中顯著富集（圖1h），其亞類黃酮糖苷和黃酮醇是核心組成；脂肪酰類化合物中，二十烷酸和脂肪酸主要在GTs中積累（圖1e，g）。
此外，KEGG富集分析顯示，GTs代謝物顯著富集于倍半萜與三萜生物合成、ABC轉運體、苯丙素類合成等次生代謝核心通路，進一步驗證了GTs作為藥用活性物質合成工廠的功能。這些結果為解析艾草GTs的發育與代謝調控機制提供了關鍵分子基礎，并為藥用植物次生代謝研究提供了新的單細胞層面的視角。
圖1 艾草GTs和NGTs的代謝組學研究
2、構建艾草葉片的單細胞轉錄組圖譜
通過單細胞轉錄組學技術，艾草葉片的高分辨率細胞圖譜首次被構建，主要內容如下：
1、利用10x Genomics平臺從組織培養嫩葉中分離原生質體，獲得24,174個初始細胞數據，經嚴格質控后保留22,032個高質量細胞，平均每個細胞約30,582條reads，中位表達基因1595個（圖2a-b）。
2、通過UMAP無監督聚類，將艾草葉片分為18個細胞簇（圖2c），其中葉肉細胞(Mesophyll cells，MCs)占主導地位（九個簇），維管細胞(Vascular cells, VCs)分布于四個簇，表皮細胞(Epidermal cells，ECs)單獨形成簇8，其余四個簇因缺乏特異性標記基因被歸類為未知類型(Unknown cell types，UN)。
3、基于同源標記基因分析，結合功能富集（GO）結果，明確了三大核心細胞類型（圖2d，h）：MCs、VCs、ECs。
4、通過RNA原位雜交實驗（圖2e-f）和GO功能分析（圖2g-h），證實了MCs和ECs分類的可靠性，為后續研究提供了堅實的細胞類型注釋基礎。
綜上，單細胞轉錄組圖譜的構建為解析艾草GTs的發育與代謝調控機制提供了關鍵分子框架，并推動了藥用植物特化代謝研究的單細胞層面進展。
圖2 艾草單細胞轉錄圖譜的構建
3、子聚類分析區分了艾草的GT細胞類型
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通過子聚類分析和多組學驗證，艾草葉片中GTs的細胞類型被精準區分，其主要內容如下：
1、在腺毛細胞類型鑒定中，首先，通過UMAP子聚類分析，ECs(Cluster 8)被初步鑒定，在分辨率0.4下可將其劃分為5個子簇(EC_0-EC_4)（圖3a-b）。其次，利用腺毛標記基因同源物的特異性表達，確認EC_1為GT細胞類型（圖3c）。最后，結合RT-qPCR驗證，發現腺毛標記基因在手動刮取的毛狀體(Trichome, TR)中顯著高于無毛狀體組織(Petiole tissue devoid of epidermis, PNE)，進一步支持了EC_1的腺毛注釋（圖3d-e）。
2、在代謝功能注釋中，透過GO富集分析，腺毛(EC_1)中偏好表達的基因顯著富集于脂肪酸延長、角質層發育、脂質轉運和類黃酮生物合成等次生代謝相關過程（圖3c，h）。結合批量RNA-seq比較，富含腺毛的葉柄表皮(Petiole epidermis)中上調基因和PNE中下調基因均富集于脂肪酸生物合成和脂質轉運通路（圖3f-i），表明腺毛所在表皮組織是次生代謝的核心場所。其中，EC_1中高表達的基因與腺毛中次生代謝物的合成與轉運功能相關（圖3j，k），并通過RT-qPCR驗證了其中兩個關鍵基因(LTP和POD)在TR中呈現特異性高表達（圖3l）。
3、對于其他表皮細胞類型注釋，EC_4因特異性表達氣孔保衛細胞(stomatal guard cell，GC)標記基因同源物(如LIGB、GSTT1、OPR1、BI-1)，被注釋為GC，其表達模式與公開單細胞數據集一致。EC_0、EC_2和EC_3因缺乏特異性標記基因，被歸類為EC和UN（圖3c）。
圖3 艾草葉中GT細胞類型的鑒定
4、艾草GTs的發育軌跡分析
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為闡明艾草GTs的發育軌跡，利用擬時序分析(pseudotime analysis)，將所有細胞定位在一條動態的擬時序軌跡上，以高分辨率重建了GTs和ECs發育進程（圖4a）。結果顯示，主要由ECs組成的分支被定義為“前分支”(pre-branch)，并在軌跡中識別出一個關鍵分化節點(node 1)，該節點將細胞分為三種狀態：State 1（ECs主導）、State 2（ECs與GTs過渡態和State 3（GTs富集），揭示了腺毛發育的動態過程（圖4a-c）。其中，腺毛標記基因的轉錄積累模式沿擬時序軌跡映射，表明其主要在軌跡末端(State 3)高表達（圖4d）。此外，總計106個擬時序依賴基因（PDGs）從分化軌跡中被鑒定，它們涉及多個轉錄因子家族（圖4f），其可能與GTs發育相關。若再進一步劃分，則可將PDGs分成三個模塊（圖4e），均富集于“次生代謝過程”，且“模塊1”（含最多PDGs）進一步富集于生物合成、脂質結合、細胞生長及DNA結合TF活性，與現有的腺毛發育受復雜轉錄網絡調控研究一致。最終，12個可能參與腺毛發育調控的候選基因被篩選（圖4g），主要涉及HD-ZIP家族，MYB家族、bHLH家族、WRKY家族等。這些發現表明，艾草GTs的發育受多個保守TF家族構成的復雜轉錄網絡調控。
圖4 艾草GT發育的擬時序軌跡分析
5、艾草GTs細胞類型特異性的倍半萜生物合成
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根據上述代謝組分析可知，艾草GTs中富含結構多樣的倍半萜類化合物（圖1e-f）。其中，功能重要的倍半萜在GTs中顯著積累（圖5a）。為解析倍萜生物合成的細胞類型特異性，MVA途徑相關基因的單細胞表達模式首先被解析。結果顯示，TPS-a亞家族的一組關鍵倍萜合成基因在不同細胞類型中表現出差異化的表達譜（圖5b）。為明確這些基因與不同細胞群體間的關聯，基于艾草葉片的單細胞圖譜構建的MVA途徑基因與TPS基因的共表達網絡，總計9個上游途徑基因和7個TPS基因被成功捕獲（圖5c）。結合系統發育樹，這些TPS基因被分成兩個明顯的分支（圖5d）。其中，第一分支與單萜生物合成相關，另一分支則與倍萜生物合成活性相關。基于上述聚類結果，推測并成功驗證出：AarTPS52為β-法呢烯合酶（圖5e）；AarTPS77為β-石竹烯合酶，主要產物為β-石竹烯（圖5f）；AarTPS95和AarTPS96主要負責合成胚芽烯A及其熱解產物β-欖香烯（圖5g）。
為預測調控GTs的形成與萜類合成相關的潛在轉錄因子，進一步對AarTPS52、AarTPS77、AarTPS95和AarTPS96基因轉錄起始位點上游2000 bp的啟動子序列進行生物信息學分析（PlantCare數據庫），總計51類順式調控元件被鑒定，其中包括激素響應元件、脅迫響應元件及大量MYB/MYC結合位點（尤以AarTPS95和AarTPS77為著），暗示這些TPS可能受特定TFs調控，但其具體機制仍需進一步研究。
圖5 艾草葉細胞類型特異性倍半萜的生物合成
研究小結
本研究對艾草GTs進行了全面的代謝組學分析，揭示出GTs與NGTs間顯著的代謝差異。尤為重要的是，單細胞轉錄組技術首次在艾草中被應用，系統解析了組織分化與次生代謝物生物合成的分子機制（圖6）。研究內容主要如下：
1、通過液相色譜-質譜聯用(LC-MS)和氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)，鑒定出GTs與NGTs間的969種DAMs，其中GTs顯著富集萜類、黃酮類及脂肪酰類代謝物，尤以倍半萜類占比最高。
2、構建的艾草葉片單細胞轉錄組圖譜，注釋出MCs、ECs、VCs、GCs及GTs等細胞群。
3、揭示了GTs的連續發育軌跡，并篩選出調控GTs發育的關鍵候選TFs。
4、鑒定出β-石竹烯合成酶AarTPS77和β-法呢烯合酶AarTPS52，并發現AarTPS95和AarTPS96可催化生成胚芽烯A及12種倍半萜衍生物?？偟膩碚f，該研究為解析艾草GTs發育及次生代謝物積累機制提供了新見解，助力提升藥材質量。
圖6 艾草葉單細胞轉錄圖譜示意圖
單細胞轉錄組測序：是在單個細胞水平進行高通量測序的技術，能夠有效解決細胞異質性，有助于發現新的稀有細胞類型，深入了解細胞生長過程中的表達調控機制。利用微流控系統通過序列標簽（barcode和UMI）區別群體中的不同細胞和轉錄本，獲得單細胞水平的基因表達譜。
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