?一、 全基因組甲基化測序概述?
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全基因組甲基化測序結合了亞硫酸氫鹽轉化（bisulfite conversion）方法與新一代高通量測序技術，可在單堿基分辨率水平上高效地檢測全基因組DNA甲基化狀態。亞硫酸氫鹽處理可以使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，PCR擴增所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。對 PCR產物進行高通量測序，與參考序列比對，即可判斷CpG/CHG/CHH位點是否發生甲基化。
二、 全基因組甲基化測序研究內容
全基因組甲基化圖譜（DNA methylation profiling）及單樣品高低甲基化位點在基因組不同區域的分布：全基因組甲基化測序可全面、精確地檢測全基因組DNA甲基化狀態，為更深入的表觀遺傳調控分析奠定基礎。在全基因組甲基化圖譜的基礎上，對基因組不同染色體、不同基因區域、不同序列環境、不同基因功能元件如啟動子、外顯子、內含子、UTR區的胞嘧啶甲基化狀態進行分析，有助于從多個角度研究基因的功能及調控。
研究流程示例
多樣品間的差異性甲基化區域（DMR）分析：全基因組甲基化測序不但可使研究者在基因組規模洞察不同生物之間在DNA 甲基化水平和模式上的差異, 也可用于研究同一物種多個樣品間的差異性甲基化區域（differentially methylated regions DMRs）。
基因組的甲基化狀態具有一定的時空特異性。對某一物種，不同的環境、不同的發育階段、不同類型的樣品（細胞、組織、個體）所反映的甲基化狀態可能是不同的，存在著差異性甲基化區域。其中有些是與基因調控有關的功能區域。鑒定、分析這些區域及其所在的基因或CpG島，對發育和腫瘤等生命過程研究有一定意義。
研究流程示例
三、 全基因組甲基化測序實驗技術路線
全基因組甲基化測序實驗流程
四、 全基因組甲基化測序樣品要求（基因組DNA）
樣品純度：OD 260/280值應在1.8～2.0 之間； RNA 應去除干凈；
樣品濃度：最低濃度不低于50ng/μl；
樣品總量：每個樣品總量不少于15μg；
樣品溶劑：應溶解在H20或TE (pH 8.0)中；
樣品運輸：DNA低溫運輸（-20℃）；在運輸過程中用parafilm將管口密封好，以防出現污染。
五、全基因組甲基化測序數據分析技術路線
六、全基因組甲基化測序數據分析內容
1. 測序數據質量控制?
包括：總reads數、總base數，Q20比例、Q20位點分布圖、堿基分布圖。
2. 測序數據預處理?
包括：去除總體質量偏低的reads，將質量大于20堿基所占比例小于50%的reads去除；去除3’端質量Q低于20的堿基；去除reads中所含有的接頭序列；去除長度小于20的測序片段(reads)，去除含有低質量N堿基的reads。
3. 轉化效率評估?
使用lamda噬菌體基因組作為內參，評價BS轉化效率。
4. 全基因組比對和mapping率統計
使用bismark軟件將預處理后的reads比對到基因組，統計mapping率、樣本整體甲基化水平，每個CpG\CHG\CHH位點的測序深度和甲基化比例。
5. CpG島區域、啟動子區域及整個基因組的覆蓋及不同深度關系
6. CpG/CHG/CHH位點覆蓋率、測序深度、甲基化比例和染色體分布
1) CpG/CHG/CHH位點測序深度
2) CpG/CHG/CHH位點甲基化比例
3) CpG/CHG/CHH位點染色體分布
4) 高甲基化位點（甲基化比例>70%）和低甲基化位點（甲基化比例<30%）的基因功能區分布。
5) 甲基化程度（%）對于基因的不同功能區域的分布。
6) 甲基化程度（%）對于基因本體和上下游區域的分布。
7) 甲基化程度（%）對于CpG island,shore和shelf區域的分布。
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7. 差異甲基化位點和區段篩選
使用fisher檢驗篩選差異甲基化CpG/CHG/CHH位點和甲基化區段。
8. 基因promoter、TSS、gene body區域甲基化水平計算和篩選
根據已有基因注釋，計算基因的promoter、TSS、gene body等區域的甲基化情況，并據此篩選差異甲基化的基因。
9. 差異甲基化位點或區段的CpG島注釋和基因注釋
1) 差異甲基化位點或區段CpG島分布
2) 差異甲基化位點或區段不同基因功能元件分布
3) 差異甲基化位點或區段染色體分布
10. 全基因組甲基化圖譜
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11. 甲基化和表達譜數據的聯合分析
將甲基化數據和表達譜數據結合分析，將基因的差異甲基化和差異表達進行關聯，可進行差異基因的甲基化情況聚類熱圖、不同基因區域甲基化和表達譜相關性計算和作圖。
12. GO和KEGG等功能分析和作圖
13. 客戶定制分析
可根據客戶的研究需求，協商定制個性化分析內容
甲基化測序應用案例
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- 全基因組甲基化測序揭示蠶基因組稀疏的甲基化
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昆蟲的表觀遺傳學調控可以反映其多樣的生物反應過程，本研究采用Illumina高通量亞硫酸鹽測序，檢測了模式生物蠶在單堿基水平的甲基化情況。保守估計，基因組中0.11%的胞嘧啶被甲基化，且可能全部存在于CG二核苷酸中?；騾^域CG甲基化是非常豐富的，這可能與基因表達水平相關，同時也暗示了甲基化在基因轉錄中扮演了一個正面的角色。研究人員發現轉錄元素、啟動子及核糖體DNAs低甲基化，相反，基因區域與基因座匹配的小RNAs被充分甲基化。該研究有助于我們對于昆蟲表觀遺傳的理解。
原文：Single base–resolution methylome of the silkworm reveals a sparse epigenomic map. Nature Biotechnology.2010,28:216-20.