滴蟲病（Histomonosis）是鶉雞類的一種寄生性疾病，其特征是肝臟壞死，通常在火雞中更為致命，而在雞中沒有那么嚴重。滴蟲病是火雞的原生動物寄生蟲疾病，同時也有雞，野雞和野禽類患病，與兼性細菌作用引起黑頭病。 這種疾病在火雞中具有高發(fā)病率和死亡率。
盡管雞對這種病癥具有抵抗性，但在繁殖雞和放養(yǎng)的雞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了染病。 寄生蟲攝入如異刺線蟲蟲卵或蚯蚓或糞便中的幼蟲，潛伏期為15-20天。
用體外減毒的疫苗接種已被實驗證明具有保護組織滴蟲的作用。但是，疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的保護機制還尚未得到解決。因此，本研究的目的是評估Ⅰ型免疫應(yīng)答的標志性細胞因子在接種或感染宿主中的位置和數(shù)量分布模式。細胞因子mRNA陽性細胞空間，時間分布模式在組間和種間的差異是明顯的。
本文細胞定量分析報告指出，與對照組相比，接種減毒或有毒的接種物4DPI的火雞盲腸中的IFN-γmRNA陽性細胞百分比顯著降低。之后伴隨著的是IFN-γ或IL-13 mRNA的細胞激增，在10 DPI時的達到增量峰值。相反，接種疫苗后的火雞在4 DPI時顯示出盲腸IFN-γmRNA陽性細胞的輕微增加，之后陽性細胞計數(shù)變得與對照相當(dāng)。
表達特征細胞因子T helper（Th）1 / Th2的禽細胞的原位信息分別為INF-γ和IL-13，本研究采用原位雜交（ISH）方法定位到盲腸，肝臟和脾臟中的細胞。 接種疫苗和/或感染火雞和雞。使用免疫熒光（IF）進行疫苗接種或感染期間募集的免疫細胞的鑒定，以揭示來自雞的所選樣品中B細胞，T細胞和巨噬細胞/單核細胞群體的變化。
維也納醫(yī)學(xué)院的專家們將此文章發(fā)表于Frontiers in Immunology上。
本文中99%實驗數(shù)據(jù)來源于奧地利TissueGnostics公司TissueFAXS Cytometry技術(shù)。
免疫組化樣本分析利用HistoQuest分析軟件，任意選擇8個2mm2感興趣區(qū)域（ROI），然后進行組織原位單細胞定量分析。應(yīng)用軟件“一鍵拆色”（colorseparation）功能將圖像拆分為DAB和蘇木素兩個染色通道。使用蘇木（Hematoxylin）作為master channel，根據(jù)細胞核染色計算ROI 2mm2的細胞總數(shù)；進而得到蘇木素面積 vs 染色強度的散點圖數(shù)據(jù)結(jié)果，在散點圖上進行圈選識別陽性細胞。根據(jù)陰性對照，識別出NBT-BCIP陽性細胞。此外，通過“反向回溯”功能確定NBT-BCIP陽性細胞識別的正確性。NBT-BCIP染色細胞占總細胞的百分比輸出SPSS格式報告。
在三色熒光樣本中識別單細胞，使用TissueQuest分析軟件，將DAPI作為master channel。DAPI面積 vs 染色強度的散點圖數(shù)據(jù)結(jié)果，在散點圖上進行圈選識別陽性細胞。在散點圖中，還可以根據(jù)熒光信號強弱設(shè)門圈選細胞數(shù)量，T細胞， B細胞和單核細胞。
圖1： 通過原位雜交法將有毒力和減毒的組織滴蟲定位于盲腸和肝臟中，深紫色區(qū)域可看到染色的組織滴蟲（示例以紅色箭頭顯示）。通過樣本可見，多數(shù)有毒力組織滴蟲被大量涌入的單核細胞所包圍，相對于而只有少數(shù)減毒組孔蟲被的單核細胞所包圍。樣品是從接種毒性組織滴蟲后10天（DPI）（感染組）的火雞中，和接種21 DPI減毒組織滴蟲（疫苗接種組火雞）接種的火雞中收集。 小圖中用高倍顯示各組織樣品中的組織滴蟲和周圍細胞情況。
圖2：在盲腸和肝臟利用原位雜交方法定位的干擾素γ（IFN-γ）mRNA陽性細胞的分布。在只接受減毒寄生蟲的火雞組和那些接種了毒性組織滴蟲的火雞組之間，主要受感染器官中的細胞因子mRNA陽性細胞是明顯的。使用IFN-γmRNA陽性細胞，給出代表性分布模式，其中陽性細胞區(qū)域由紅色箭頭指示。在接種后4天（dpi），陽性細胞很少分布在盲腸中，隨后在7和10 dpi處變得豐富，陽性細胞的積累局限于接受減毒培養(yǎng)的鳥的固有層（a），而毒性強組織滴蟲引發(fā)陽性細胞進一步分布到肌層，在10 DPI時粘膜褶皺丟失（b）。在肝臟中，偶爾發(fā)現(xiàn)陽性細胞散布在肝細胞和淋巴聚集體之間（c），或者當(dāng)受到有毒力的組織滴蟲影響時，包含單核浸潤分布更為廣泛（d）。
圖3：干擾素γ(IFN-γ)mRNA陽性細胞定量。在火雞(a)和家雞(b)的盲腸、肝臟和脾臟中，接種了經(jīng)減毒和/或有毒力的組織滴蟲(Histomonas meleagridis)后，用TissueFAXS及其定量軟件HistoQuest對陽性細胞進行定量。將每個處理組中mRNA陽性細胞百分比的平均值與接種后各天的年齡匹配對照進行比較。
圖4：定量分析白細胞介素（IL）-13mRNA陽性細胞。在用減毒和/或毒力的組織滴蟲（Histomonas meleagridis）接種的火雞（a）和家雞（b）組的盲腸，肝臟和脾臟中定量陽性細胞。將從每個治療組獲得的平均百分比與年齡匹配的對照進行比較。
圖5：細胞因子mRNA陽性細胞的比較顯示，在表達干擾素γ（IFN-γ）或白細胞介素（IL）-13的mRNA的細胞豐度中顯示出的不同量級。圖（a）顯示了火雞IFN-γmRNA陽性細胞的百分比與各組織類型中的IL-13mRNA陽性細胞定量，無論其處理條件如何，在接種后不同天數(shù)略有變化。如圖（b）中所示，在整個試驗中，與各組中盲腸和脾臟中IL-13mRNA陽性細胞的百分比相比，家雞IFN-γmRNA陽性細胞的總百分比更高。在對照鳥，火雞（CT）和家雞（CC）的盲腸之間的IFN-γmRNA陽性細胞的相對數(shù)量中也可以看到顯著的差異，n = 3只/天。
圖6：免疫熒光檢測雞組織中B細胞（bu-1+）、T細胞（cd3+）和單核/巨噬細胞（kul01+）。盲腸粘膜[接種后4天（DPI）]和感染雞肝臟（14 DPI）（僅接種有毒力的組織滴蟲）的B和T細胞增加表現(xiàn)為相應(yīng)熒光染料的較高強度。 相比之下，脾臟中淋巴細胞的熒光信號（14 DPI）在同一組中相對減少。