今天，BIOTREE 技術支持工程師Novenia 將和奮斗在實驗室的小伙伴們分享一篇關于代謝組學實驗過程中溶劑選擇的文章Tuning Metabolome Coverage in Reversed Phase LC?MS Metabolomics of MeOH Extracted Samples Using the Reconstitution Solvent Composition。這是一篇2017年發表在analytical chemistry的文章，影響因子6.042。
大家都知道做代謝組學實驗的時候，因為生物樣本中包含了太多的物質，不可能使用一種儀器或者一種方法就可以把所有的物質都檢測出來，所以衍生出非靶標代謝組學。
百趣代謝組學文獻分享，非靶標代謝組學的目的是盡可能多的檢測樣本中的代謝物，但是無論是GC 還是LC，都會碰到一個問題，就是什么溶劑可以將提取干燥過的代謝物盡可能多的復溶呢。小白可能會去看文獻，結果發現一千篇文章有一千種復溶溶劑，大神則會根據自己的經驗來選擇復溶溶劑。終于，在2017年的某一天，有人站出來針對LCMS去做對比了，讓我們攜手去看一下這位大神的實驗結果吧！
百趣代謝組學文獻分享，首先，大神準備了三種樣本，40例人血清（20例健康，20例疾?。?，LB培養基以及沒有在正文結果中出現的酵母菌，用甲醇進行提取或者沉淀蛋白后干燥，再用不同比例以及不同pH的甲醇來進行復溶，最后用LC-qTOF進行檢測。詳情如下圖：
其次，讓我們一起來看一下實驗結果。
1復溶溶劑對檢測到的峰的影響
首先是LB培養基的結果。
Figure 1. Total number of detected metabolite features (y-axis) as a function of (top) the MeOH/H2O ratio expressed in % MeOH (x-axis) .
第一個圖是色譜圖的峰數量隨甲醇比例的變化，第二個是根據定性出來的代謝物峰面積做了個PCA模型，果然，明晃晃的數據顯示復溶試劑中甲醇的比例與代謝物的檢測具有明顯的關系，隨著甲醇比例的升高，可以檢測到的峰的數量在減少。
再看pH。
Figure 2. Total number of detected metabolite features (y-axis) as a function of (top) the MeOH/H2O ratio expressed in different pH.
這個數據就沒有那么明晃晃了，檢測出來的峰數量沒有肉眼可見的明顯差異，代謝物的峰面積雖然有個趨勢卻又有一些混亂看不清楚，所以大神決定將這個條件放棄，專心研究甲醇的比例。
百趣代謝組學文獻分享，接下來，大神將10種標準品加到LB培養基里，研究復溶溶劑與物質極性有沒有關系。他在這里使用指數log P來表示物質極性的大小，log P越大，極性越小。
雖然不知道為什么，但是感覺很厲害的樣子。結果發現log P小于5的物質的響應，如ATP、亞精胺都隨著甲醇比例的減小而增加，而log P為7的棕櫚酸則隨著甲醇比例的減小而減小，由此可見復溶溶劑的極性與物質的極性是相關的。
Figure 3. Examples of EICs for selected spiked in metabolites in different MeOH ratios, as indicated by orange and blue.
最后，根據log P來預測了一下HMDB中的人血清的數據，這是一個預測的數據。
Figure 4. The predicted log P distribution (x-axis) of all known metabolites in human blood as listed in the Human Metabolome Database (HMDB).
對HMDB里面的大約13000中物質按照極性進行分類，也就是給每個物質一個預測的log P值，結果顯示log P小于5的有74%，也就是說極性大的物質比較多，因此做血清實驗的時候，使用親水的溶劑更好。百趣代謝組學文獻分享，log P大于7的只占19%，表明使用親水的復溶溶劑可能難以將這些物質檢測出來。
2不同比例甲醇復溶得到的代謝物的量的變化
Figure 5. Effect of reconstitution solvent composition on metabolome coverage.
首先非靶標檢測。用100%水和100%甲醇復溶，分別得到了檢測到的物質列表，并作為接下來靶標實驗的目標物質。
其次，用0%甲醇、50%甲醇、100%甲醇復溶，分別檢測非靶中得到的物質。結果分析：50%甲醇與0%甲醇相比，fold change小于1的占57%,大于1的僅占5%；50%甲醇與100%甲醇相比，fold change不變的占61%，大于1 的占28%。結果表明用水提取時，干燥后加甲醇可能會導致物質的丟失，而用甲醇提取時，干燥后加水的影響不大。
3復溶溶劑對差異物的影響
最后，大神研究了復溶溶劑對差異物的影響，畢竟我們做代謝組學就是為了尋找差異物。
Figure 6. Work flow for metabolomics comparison of MeOH extracts of serum from 20 healthy control individuals and 20 lymphoma patients using three different reconstitution mixtures.
通過兩組樣本的比較，使用了三種復溶溶劑，非靶標檢測最后得到的結果顯示差異很大。100%復溶后檢測可以找到6種差異物，然而50%甲醇以及100%甲醇沒有找到差異物。
Figure 7. Box-whisker plots for N-Acetyl-methionine which was one of the six metabolites that significantly differed between control and lymphoma patients (left).
然后大神就對其中一個物質進行分析，發現這個物質在50%甲醇及100%甲醇中峰型極差，尤其是100%甲醇中的峰型可能都不會被軟件定性為一個物質。所以復溶溶劑對差異物的篩選有很大影響，選擇復溶溶劑是一件很重要的事。
好了，所有的實驗都做完了，也分析完了，那么最后我們能得到什么結論呢？
百趣代謝組學文獻分享，對于血清樣本來說，100%水的溶劑比較好，除此之外的其他樣本，親水的溶劑比較好。大家在投稿的時候有可能會被問為什么這么選擇復溶溶劑，那么這篇文章也許可以作為一個證明材料。
4文章延伸
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