2023年2月16日，暨南大學(xué)粵港澳中樞神經(jīng)再生研究院李曉江教授，李世華教授，閆森研究員，聯(lián)合中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)研究員，在Nature Biomedical Engineering 上發(fā)表了題為：Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington's disease的研究論文。該工作利用病毒載體表達(dá)CRISPR/Cas9基因編輯的技術(shù)敲除和修復(fù)亨廷頓豬模型的突變基因，首次在國際上證明基因治療能有效的改善神經(jīng)退行性疾病大動物模型的病理變化以及行為癥狀。
利用這個基因敲入豬模型，閆森等研究人員通過CRISPR/Cas9引起的同源臂重組將變異亨廷頓基因序列替換為正常人亨廷頓基因序列。同時還測試了腦部直接注射及周圍靜脈注射AAV病毒載體攜帶的CRISPR/Cas9對亨廷頓疾病模型豬的治療作用， 兩種方法都可以把變異亨廷頓基因序列替換為正常基因序列, 并能有效治療大動物模型的病理變化以及運(yùn)動癥狀。同時，該研究從多方面評估了這一治療方法的安全性。亨廷頓疾病模型豬基因治療的方式也為治療其他神經(jīng)退行性疾病提供了理論基礎(chǔ)與新的思路。
近十年中，第三代載體（AAV9）被確定在腦和 脊髓中分布廣泛，同時靶向神經(jīng)元和星形細(xì)胞。與其他自然血清型不同，AAV9 在靜脈注射后很容易穿過血腦屏障，具有 微創(chuàng)治療的前景。因此，AAV9 已成為 AAV 介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的金標(biāo)準(zhǔn)。
實驗部分
文章作者使用原位定量分析作為主要手段，采用WB和ELISA作為校驗。在腦部立體注射后4個月，免疫熒光染色顯示GFP和Cas9 - HA信號在注射腦區(qū)分布豐富。在實驗設(shè)計中，通過AAV攜帶綠色熒光蛋白和AAV攜帶Cas9在注射后目標(biāo)腦區(qū)的表達(dá)量，證明其量化關(guān)系具有一致性，由此確立了實驗基礎(chǔ)的可行性。
在本文中，研究者以AAV9為載體，通過原位多色熒光的量化分析，建立了一種關(guān)于mHTT的潛在治療及評估手段。從研究的方法學(xué)驗證，到關(guān)鍵數(shù)據(jù)的量化分析結(jié)果，以及通過靜脈注射并驗證其透過血腦屏障的效果驗證，皆使用了TissueFAXS Cytometry全景組織細(xì)胞定量分析技術(shù)。
在此基礎(chǔ)上，TissueFAXS Cytometry技術(shù)還可以提供單細(xì)胞水平病毒表達(dá)的定量分析，以及多標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞或蛋白在腦區(qū)中的分布情況的定位研究，對于在腦神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究者們來說，相信這些數(shù)據(jù)可以提供更好更有利的觀點佐證。
Fig 1 豬大腦組織中Cas9和GFP蛋白的表達(dá)量分析
B：注射AAV-GFP后的豬大腦紋狀體GFP和Cas9-HA的免疫熒光樣本蛋白表達(dá)。
在實驗基礎(chǔ)確立后，通過TissueFAXS Cytometry技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AAV CRISPR/Cas9的注射導(dǎo)致gRNA在注射的腦區(qū)和神經(jīng)元, 細(xì)胞中廣泛的表達(dá)。
通過對比發(fā)現(xiàn)，不但注射AAV9-Cas9結(jié)合AAV9 HTT-gRNA-RFP-20Q（下行）與AAV-Cas9結(jié)合AAV9-gRNA-RFP-20Q相比，mHTT的出現(xiàn)減少，除了替換CAG重復(fù)外，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的indel突變也可以改變閱讀框，終止mHTT蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致mHTT的表達(dá)減少。
