Cancer Res. (IF=16.6)｜重慶醫(yī)科大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)：ACSL4驅(qū)動(dòng)磷脂重塑解析TNBC轉(zhuǎn)移，點(diǎn)亮靶向聯(lián)合化療新路徑

英文標(biāo)題：ACSL4-Mediated Membrane Phospholipid Remodeling Induces Integrin β1 Activation to Facilitate Triple-Negative Breast Cancer Metastasis

中文標(biāo)題：ACSL4介導(dǎo)的膜磷脂重塑誘導(dǎo)整合素β1激活以促進(jìn)三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移

發(fā)表期刊：Cancer Research

影響因子：16.6

客戶單位：重慶醫(yī)科大學(xué)

百趣提供服務(wù)：定量脂質(zhì)組學(xué)、經(jīng)典脂質(zhì)組學(xué)

研究背景

乳腺癌是女性常見癌癥，具有顯著異質(zhì)性。三陰性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer, TNBC)占所有乳腺癌病例的12%~17%，缺乏雌激素受體(Estrogen Receptor, ER)、黃體酮受體(Progesterone Receptor, PR)和HER2，預(yù)后較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高。脂質(zhì)代謝異常可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，但其在TNBC中的具體機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞中ACSL4異常上調(diào)，與不良預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)。ACSL4通過催化PUFA生成PUFA-CoA并將其酯化為磷脂，增加磷脂不飽和度，改變膜生物物理性質(zhì)，促進(jìn)脂筏中整合素β1和CD47的富集與相互作用，激活整合素β1/FAK信號(hào)通路，促進(jìn)TNBC轉(zhuǎn)移。此外，ACSL4抑制劑PRGL493聯(lián)合紫杉醇和順鉑可顯著抑制TNBC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為TNBC治療提供了新策略。

ACSL4調(diào)控機(jī)制和靶向治療示意圖
 

研究結(jié)果

1、 在轉(zhuǎn)移性TNBC腫瘤中，磷脂不飽和度升高

為了確定轉(zhuǎn)移性TNBC腫瘤的脂質(zhì)譜，研究人員采用 LC/MS-MS脂質(zhì)組學(xué)分析，檢測(cè)了NCG小鼠肝臟中四對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中的脂質(zhì)代謝物變化。共鑒定出785種脂質(zhì)代謝物，其中71種在轉(zhuǎn)移瘤中顯著增加，70種顯著減少。磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine, PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine, PE)是轉(zhuǎn)移瘤中變化最顯著的主要脂質(zhì)（圖1A-C）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤中多不飽和磷脂(PUFA-containing Phospholipids, PUFA-PL)的豐度顯著升高，而飽和脂肪酸磷脂(saturated fatty acid-containing phospholipids, SFA-PL)和單不飽和脂肪酸磷脂(monounsaturated fatty acid-containing phospholipids, MUFA-PL)的豐度顯著降低。轉(zhuǎn)移性腫瘤傾向于產(chǎn)生更多含有4個(gè)或更多不飽和鍵的總磷脂、PE和PC，且在sn-2位置的多不飽和脂肪酰基鏈（18–22碳）更豐富（圖1D-H）。這些結(jié)果表明，含有長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(long-chain PUFAs, LC-PUFA)的磷脂是轉(zhuǎn)移性TNBC的代謝特征。

圖1. 在轉(zhuǎn)移性TNBC腫瘤中，磷脂不飽和度升高

2、 ACSL4升高與TNBC預(yù)后不良相關(guān)，并有助于轉(zhuǎn)移

TNBC相較于ER陽性乳腺癌(ER+BC)具有更高的轉(zhuǎn)移傾向，且其腫瘤細(xì)胞中富含多不飽和磷脂(PL-PUFAs)，而ER+BC則富含單不飽和磷脂(PL-MUFAs)。這提示TNBC存在獨(dú)特的磷脂重塑現(xiàn)象，可能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。為了探索TNBC細(xì)胞中調(diào)節(jié)PUFA-磷脂重塑的關(guān)鍵酶，作者通過分析數(shù)據(jù)集 METABRIC，發(fā)現(xiàn)ACSL4等基因在TNBC中與磷脂重塑相關(guān)，且ACSL4在TNBC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。研究人員通過免疫組化染色評(píng)估了30例TNBC患者配對(duì)腫瘤和正常組織中ACSL4蛋白水平，發(fā)現(xiàn)TNBC組織中ACSL4蛋白染色更強(qiáng)（圖2A-B）。在包含95例腔內(nèi)乳腺癌、34例HER2陽性乳腺癌和31例TNBC患者的組織微陣列芯片(Tissue Microarrays, TMA)中，TNBC的ACSL4 IHC評(píng)分高于其他亞型（圖2C-D）。Kaplan-Meier生存分析顯示，ACSL4高水平與乳腺癌患者的N期和較差總生存期顯著相關(guān)（圖2E-F）。ACSL4表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，轉(zhuǎn)移性TNBC患者的原發(fā)腫瘤中ACSL4 mRNA水平更高（圖2G-H）。ACSL4表達(dá)與遠(yuǎn)端無轉(zhuǎn)移生存率呈負(fù)相關(guān)。在 NCG小鼠模型中，與原發(fā)腫瘤相比，肺和肝轉(zhuǎn)移瘤中ACSL4水平更高。ACSL4敲低損害了TNBC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而異位ACSL4則恢復(fù)了這些能力。在NCG小鼠模型中，MDA-MB-231中ACSL4的缺失顯著誘導(dǎo)CTC凋亡，降低肺和肝臟的轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)，并減少轉(zhuǎn)移灶中Ki-67陽性細(xì)胞（圖2J-O）。這些結(jié)果表明ACSL4是TNBC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，可作為惡性TNBC的生物標(biāo)志物。

圖2. ACSL4增強(qiáng)與TNBC預(yù)后不良相關(guān)，并促進(jìn)轉(zhuǎn)移

3 、ACSL4促進(jìn)TNBC細(xì)胞中PUFA-PLs的產(chǎn)生

為了揭示ACSL4在TNBC細(xì)胞中對(duì)PUFA-PLs生成的調(diào)控機(jī)制，研究人員通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACSL4在TNBC細(xì)胞中通過促進(jìn)多不飽和脂肪酰基磷脂(PUFA-PLs)的生成來調(diào)節(jié)細(xì)胞膜磷脂組成（圖3A），并影響TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，ACSL4缺失導(dǎo)致PUFA-CoA減少，SFA-CoA和MUFA-CoA增加，同時(shí)PUFA-PLs（如PUFA-PC和PUFA-PE）也減少。ACSL4敲低的細(xì)胞中，飽和程度為4的磷脂（包括PE和PC）百分比降低，而飽和程度為1的磷脂百分比增加。此外，ACSL4敲除顯著降低了特定LC-PUFA-PLs（如PE(18:0/20:4)和PE(16:0/20:4)）的水平（圖3C-D）。這些變化導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，表明ACSL4對(duì)TNBC細(xì)胞膜磷脂組成和生物學(xué)特性有顯著影響（圖3E-G）。另外，研究還證明，ACSL4介導(dǎo)的PUFA-PLs變化影響TNBC轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)中，ACSL4敲低的腫瘤細(xì)胞分別用SFA-PE、MUFA-PE和PUFA-PL處理后，外源性PAPE脂質(zhì)體顯著恢復(fù)了細(xì)胞的侵襲能力和失巢凋亡抵抗，并增加了轉(zhuǎn)移負(fù)荷及Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量（圖3H-K）。PAPE未顯著降解為AA或LPA，且PLA2抑制劑giripladib不影響PAPE處理后的細(xì)胞侵襲和失巢凋亡抗性，表明PAPE本身而非其代謝物在ACSL4沉默的乳腺癌細(xì)胞中起代償作用。ACSL4通過調(diào)節(jié)膜磷脂組成和不飽和度，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、抗凋亡和轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)。

圖3. ACSL4促進(jìn)TNBC細(xì)胞PUFA-PL的產(chǎn)生

4 、磷脂重塑促進(jìn)了ITGB1和CD47在脂筏中的定位和相互作用

為了探究ACSL4介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制，研究人員分析了ACSL4相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)乳腺癌腫瘤中的基因表達(dá)譜（來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)ACSL4表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路存在相關(guān)性，例如細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用和黏著斑形成。研究表明，膜磷脂飽和度會(huì)影響脂筏中受體的定位和激活，而ACSL4介導(dǎo)的磷脂不飽和可能激活脂筏中的促轉(zhuǎn)移信號(hào)分子，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)顯示，ACSL4敲除后，脂筏中的CD47和ITGB1蛋白水平顯著降低，而外源性PAPE脂質(zhì)體處理可恢復(fù)其水平（圖4A-E）。此外，ACSL4敲除削弱了CD47與ITGB1的相互作用，而PAPE脂質(zhì)體處理可部分挽救這種相互作用，但脂筏抑制劑MβCD可阻斷該效應(yīng)（圖4G）。這些結(jié)果表明，ACSL4介導(dǎo)的磷脂重塑通過調(diào)節(jié)CD47和ITGB1在脂筏中的定位和相互作用，促進(jìn)了TNBC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

圖4. 磷脂重塑促進(jìn)了ITGB1和CD47在脂筏中的定位和相互作用

5 、CD47對(duì)于不飽和磷脂介導(dǎo)的整合素β1/FAK信號(hào)的激活至關(guān)重要

為了探討ACSL4介導(dǎo)的膜磷脂重塑對(duì)整合素β1(ITGB1)活性及其下游FAK信號(hào)通路的影響。通過結(jié)果表明，ACSL4缺失減少了活化整合素β1(Act-ITGB1)在脂筏中的定位和蛋白水平，但外源性PAPE脂質(zhì)體處理可恢復(fù)其水平（圖5A-D）。PAPE處理還增強(qiáng)了pFAK水平，激活了FAK信號(hào)通路，促進(jìn)了細(xì)胞侵襲和抗失巢凋亡，而這些效應(yīng)可被CAV1沉默或FAK抑制劑defactinib阻斷。此外，CD47是整合素β1/FAK信號(hào)激活和細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵因子，ACSL4缺失降低了Act-ITGB1與CD47的共定位，而PAPE處理可恢復(fù)這種共定位，但CD47沉默會(huì)削弱PAPE的恢復(fù)作用（圖5E-J）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，高表達(dá)ACSL4的TNBC腫瘤中，Act-ITGB1在脂筏中的定位增強(qiáng)，且FAK信號(hào)激活顯著增加。這些結(jié)果表明，ACSL4通過膜磷脂重塑影響整合素β1的脂筏定位和活性，進(jìn)而激活FAK信號(hào)通路，促進(jìn)TNBC細(xì)胞侵襲，而CD47在這一過程中發(fā)揮重要作用。

為了證明體內(nèi)ACSL4表達(dá)與ITGB1/FAK信號(hào)激活之間的關(guān)聯(lián)，研究人員分析了TNBC腫瘤組織中ACSL4、ITGB1和pFAK蛋白水平。高表達(dá)ACSL4的腫瘤增強(qiáng)了Act-ITGB1在脂筏中的表達(dá)和定位（圖6A-B），這與FAK信號(hào)激活增加顯著相關(guān)（圖6C-D）。

圖5. CD47對(duì)于不飽和磷脂介導(dǎo)的整合素β1/FAK信號(hào)的激活至關(guān)重要

圖6. 在TNBC樣本中，ACSL4表達(dá)水平與ITGB1和FAK激活狀態(tài)呈正相關(guān)

6 、靶向ACSL4增加TNBC對(duì)化療的敏感性，抑制TNBC的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

為了評(píng)估靶向ACSL4在TNBC治療中的潛在價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACSL4低表達(dá)的TNBC患者對(duì)紫杉醇(PAC)治療更敏感，而高表達(dá)者則表現(xiàn)為耐藥（圖7A-C）。在40例接受紫杉醇治療的患者中，耐藥腫瘤的ACSL4蛋白水平顯著更高。進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，ACSL4抑制劑PRGL493聯(lián)合紫杉醇和順鉑(Cisp)治療顯著抑制了TNBC小鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，效果優(yōu)于單獨(dú)或兩藥聯(lián)合治療（圖7D-J）。此外，PRGL493單獨(dú)處理可縮小對(duì)照TNBC細(xì)胞的腫瘤體積，但對(duì)ACSL4缺陷細(xì)胞無影響，并且治療未引起小鼠體重的明顯變化。機(jī)制上，PRGL493處理降低了腫瘤細(xì)胞中含LC-PUFAs的磷脂水平。這些結(jié)果表明，靶向ACSL4可增強(qiáng)TNBC對(duì)化療的敏感性。

圖7. 靶向ACSL4可增加TNBC對(duì)化療的敏感性并抑制其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

研究結(jié)論

TNBC患者預(yù)后差，因其侵襲性和高轉(zhuǎn)移性，且缺乏有效治療靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性TNBC細(xì)胞中磷脂不飽和度顯著增加，ACSL4（長(zhǎng)鏈酰基輔酶A合成酶4）上調(diào)，驅(qū)動(dòng)PUFA摻入磷脂，導(dǎo)致膜磷脂重塑。ACSL4介導(dǎo)的磷脂重塑促進(jìn)脂筏中整合素β1和CD47的富集及相互作用，激活整合素β1/FAK信號(hào)通路，促進(jìn)TNBC轉(zhuǎn)移（圖7）。靶向ACSL4可增強(qiáng)TNBC對(duì)化療的敏感性，為TNBC治療提供新策略。脂筏在ACSL4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，促進(jìn)整合素β1與CD47的相互作用和信號(hào)激活。CD47對(duì)整合素β1功能至關(guān)重要，其缺失會(huì)削弱ACSL4介導(dǎo)的FAK磷酸化和TNBC的侵襲及抗失巢凋亡能力。此外，聯(lián)合使用ACSL4抑制劑PRGL493、紫杉醇和順鉑可顯著抑制TNBC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，表明靶向ACSL4可增強(qiáng)化療效果。綜上所述，ACSL4介導(dǎo)的磷脂重塑是TNBC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制，靶向ACSL4有望成為TNBC治療的新靶點(diǎn)，改善患者預(yù)后。

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孔涵蕊 撰文

SY 校稿