英文標(biāo)題：Pre-Analytical Drivers of Bias in Bead-Enriched Plasma Proteomics

中文標(biāo)題：血漿蛋白組學(xué)中磁珠富集前分析階段偏差的影響因素

研究背景

血液作為臨床研究中重要的樣本類型，在生物標(biāo)志物研究領(lǐng)域（如早期疾病診斷和預(yù)后指導(dǎo)應(yīng)用等）中具有重要的研究?jī)r(jià)值。近年來(lái)，商業(yè)化的Somascan和Olink技術(shù)與基于肽段檢測(cè)的質(zhì)譜技術(shù)等檢測(cè)方法已經(jīng)應(yīng)用于大隊(duì)列血漿蛋白質(zhì)組研究中。

遇到的主要困境包括：

1. 血液樣本的復(fù)雜性：各種蛋白的含量動(dòng)態(tài)范圍跨越了12個(gè)數(shù)量級(jí)；

2. 低豐度蛋白的檢出存在偏差或漏檢；

3. 大隊(duì)列檢測(cè)儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性；

4. 前處理方法不一，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化與批次校正并不能解決所有偏差；

5. 血漿樣本通常在常規(guī)臨床實(shí)踐中以不同的處理?xiàng)l件收集，在病例對(duì)照研究中，樣本收集或處理的系統(tǒng)差異可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的生物標(biāo)志物候選物。

文章表明，約一半已發(fā)表的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究可能受到此類樣本相關(guān)質(zhì)量問(wèn)題的影響。

本研究旨在全面評(píng)估五種不同的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程在分析前各種因素方面的表現(xiàn)。

具體目標(biāo)包括：

1. 系統(tǒng)評(píng)估每個(gè)工作流程檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的能力；

2. 表征它們對(duì)常見樣本污染物（如血小板、紅細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞）的敏感性；

3. 研究標(biāo)準(zhǔn)臨床離心方案和采血試管對(duì)血漿蛋白質(zhì)組分析的影響，揭示樣本制備參數(shù)與蛋白質(zhì)組組成之間的關(guān)系；

4. 探討污染樣本是否可以通過(guò)額外的處理步驟“挽救”；

5. 為基于磁珠的工作流程的潛力和局限性提供見解，并為前瞻性研究設(shè)計(jì)和存檔樣本的回顧性質(zhì)量評(píng)估提供實(shí)用指導(dǎo)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：比較5種不同的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，所有流程均在安捷倫Bravo液體處理平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，以確保96個(gè)樣本的可重復(fù)性和高通量并行處理。在液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)方面，采用了將Evosep色譜系統(tǒng)與Orbitrap Astral耦合的先進(jìn)工作流程。

具體工作流程如下：

1. 純血漿工作流程：作為基線方法，采用簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)變性后進(jìn)行酶消化，優(yōu)化了速度和簡(jiǎn)便性；

2. 基于高氯酸沉淀中和的方法(PCA-N)：通過(guò)蛋白質(zhì)的溶解度進(jìn)行分離，對(duì)某些污染物具有抗性，用于在不使用磁珠的情況下實(shí)現(xiàn)更深入的蛋白質(zhì)組覆蓋；

3. 三種基于磁珠的富集方法：使用具有代表性表面化學(xué)性質(zhì)的磁性或非磁性磁珠。

加標(biāo)實(shí)驗(yàn)：使用各種血細(xì)胞類型（如血小板、紅細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞）以及整個(gè)酵母蛋白質(zhì)組進(jìn)行精心設(shè)計(jì)的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以系統(tǒng)評(píng)估每個(gè)工作流程檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的能力，并表征它們對(duì)常見樣本污染物的敏感性。此外，還研究了標(biāo)準(zhǔn)臨床離心方案和采血試管對(duì)血漿蛋白質(zhì)組分析的影響，以揭示樣本制備參數(shù)與蛋白質(zhì)組組成之間的關(guān)鍵關(guān)系。同時(shí)，探討是否可以通過(guò)額外的處理步驟來(lái)改善污染樣本的分析結(jié)果。

1、不同工作流程對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)能力

研究建立了一個(gè)多維度、系統(tǒng)化的實(shí)驗(yàn)框架，旨在評(píng)估5種血漿蛋白質(zhì)組學(xué)處理流程在不同前處理變量下的性能。5種流程包括：①簡(jiǎn)便的直接血漿法(neat workflow)，未經(jīng)任何蛋白富集方法；②抗污染能力較強(qiáng)的PCA-N流程，經(jīng)過(guò)高氯酸沉淀并中和；③兩種基于磁性磁珠的富集方法（強(qiáng)陰離子交換磁珠SAX與硅膠涂層磁珠Sera Sil 700）；④一種基于非磁性磁珠的富集方法(non-magnetic beads)。這些流程代表了不同的檢測(cè)深度、速度與污染敏感性之間的權(quán)衡。

本部分結(jié)果明確指出，不同流程通過(guò)各自的蛋白富集與選擇性去除機(jī)制，重塑了血漿蛋白豐度的等級(jí)結(jié)構(gòu)，有效壓縮了極端的動(dòng)態(tài)范圍，其中磁珠法表現(xiàn)出更強(qiáng)的低豐度蛋白檢出能力（但易受到血小板和PBMC污染的系統(tǒng)偏差影響），而PCA-N表現(xiàn)較溫和但更穩(wěn)定（圖1）。

2、細(xì)胞污染分析

研究通過(guò)向純凈血漿中添加不同數(shù)量的紅細(xì)胞、血小板和PBMC，系統(tǒng)評(píng)估了5種蛋白質(zhì)組學(xué)流程對(duì)細(xì)胞污染的敏感性。結(jié)果表明，磁珠法極易受到污染影響，即使低水平的PBMC(140 cells/μL)也能顯著增加蛋白鑒定數(shù)，某些條件下總檢出蛋白數(shù)高達(dá)8000–10000種。而PCA-N流程對(duì)紅細(xì)胞污染高度耐受，在不同污染濃度下保持穩(wěn)定的蛋白數(shù)（約800–900種）。neat流程對(duì)紅細(xì)胞污染敏感，對(duì)血小板污染抗性較強(qiáng)。為定量評(píng)估污染影響，研究建立了血小板、紅細(xì)胞和PBMC的高特異性蛋白標(biāo)志物panel，并據(jù)此計(jì)算“污染指數(shù)”(contamination index)和“細(xì)胞富集分?jǐn)?shù)”(cellular enrichment score)。結(jié)果顯示，非磁性磁珠法的污染指數(shù)最高，磁珠法次之，而PCA-N和neat流程對(duì)污染反應(yīng)較弱。總體而言，磁珠法在檢測(cè)靈敏度與污染易感性之間存在明顯權(quán)衡，需特別重視樣本質(zhì)量控制（圖2）。

3、酵母蛋白外源添加實(shí)驗(yàn)：低豐度蛋白檢測(cè)能力評(píng)估

為評(píng)估各流程對(duì)低豐度蛋白的檢測(cè)能力，研究人員向血漿中加入了不同比例的酵母蛋白（圖3）。結(jié)果顯示，三種磁珠法（SAX、Sera Sil 700和non-magnetic beads）在1:100稀釋條件下可鑒定2,286種酵母蛋白，顯著優(yōu)于PCA-N（471種）和 neat流程（317種），其中non-magnetic beads表現(xiàn)最優(yōu)。

進(jìn)一步分析代表性蛋白（如TDH3、RNQ1、FAB1）表明，磁珠法能在更低濃度下保持良好檢測(cè)，將濃度檢測(cè)下限提升至neat流程的100倍（如磁珠法可檢測(cè)0.01%酵母濃度，neat流程為1%）。不過(guò)，PCA-N雖穩(wěn)定但變異較大，neat流程則對(duì)低豐度蛋白檢測(cè)能力有限。

4、血小板活化與磁珠敏感性機(jī)制探討

為揭示磁珠法對(duì)血小板污染高度敏感的機(jī)制，研究比較了8種不同表面化學(xué)的磁/非磁珠與7種緩沖條件的組合，形成56種實(shí)驗(yàn)條件（圖4）。結(jié)果顯示：非磁珠在HEPES緩沖液中鑒定蛋白最多，但也表現(xiàn)出最高的血小板富集水平，可能源于其需額外離心步驟帶來(lái)血小板共沉淀。在檢測(cè)血小板活化方面，部分條件（如CaCl₂、低pH的TFA緩沖液）誘導(dǎo)血小板釋放特異蛋白（如PF4V1、PPBP），提示樣本制備本身可激活血小板。而非磁珠在PBSC緩沖中則表現(xiàn)為高血小板蛋白信號(hào)而非活化釋放，說(shuō)明部分富集源于物理保留而非生物過(guò)程。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了樣本處理方式對(duì)血小板相關(guān)偏差的影響。

5、血小板污染樣本的“補(bǔ)救”策略評(píng)估

考慮到實(shí)際臨床樣本常含血小板污染，研究測(cè)試了凍融循環(huán)與離心處理是否能補(bǔ)救，實(shí)驗(yàn)表明（圖5），磁性磁珠法污染最重，蛋白鑒定數(shù)由1400提升至2700，即使離心后仍僅下降15–20%；而非磁性磁珠法污染更嚴(yán)重但可緩解更多（降至約2000）。neat流程穩(wěn)定性較高，PCA-N流程鑒定數(shù)增幅35%但變化小于磁珠法。主成分分析表明，血小板污染是蛋白組變化的主要驅(qū)動(dòng)因素，凍融循環(huán)影響極小。離心處理可以較穩(wěn)定地降低血小板標(biāo)志物強(qiáng)度。這些結(jié)果為處理存儲(chǔ)樣本提供參考。

6、推薦的血漿樣本制備條件

在血漿蛋白組學(xué)研究中，前分析階段的樣本處理?xiàng)l件（如離心設(shè)置和試管類型）對(duì)污染水平和蛋白質(zhì)組譜影響顯著。研究顯示，低轉(zhuǎn)速離心時(shí)，凝膠試管因凝膠屏障未充分激活，血小板、紅細(xì)胞等污染顯著高于標(biāo)準(zhǔn)試管，且基于磁珠的富集方法鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)高于常規(guī)法和PCA-N法。提高離心力和時(shí)間可有效降低污染。主成分分析表明，離心是影響蛋白質(zhì)組譜的主要因素，磁珠工作流程按離心力明顯聚類，而PCA-N對(duì)處理差異敏感性低。

抗凝劑類型對(duì)磁珠工作流程影響顯著：EDTA血漿中磁珠法鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)最高，但血小板和紅細(xì)胞污染也最嚴(yán)重，而Li-肝素和血清樣本污染更少。因此，研究建議標(biāo)準(zhǔn)化抗凝劑類型，避免混合使用不同基質(zhì)樣本，且高轉(zhuǎn)速離心可作為血漿蛋白組學(xué)，尤其是磁珠富集法的優(yōu)選樣本處理?xiàng)l件，以減少污染偏差。

本研究結(jié)果為在可變樣本質(zhì)量下評(píng)估工作流程性能提供了定量框架，并為臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和質(zhì)量控制提供了指導(dǎo)。

具體結(jié)論如下：

1. 基于磁珠的富集方法雖然能提高低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)能力，但對(duì)血小板、PBMC等血細(xì)胞污染敏感，使用時(shí)需謹(jǐn)慎控制樣本質(zhì)量；

2. 高氯酸沉淀中和(PCA-N)方法對(duì)紅細(xì)胞污染具有高度抗性，對(duì)血小板衍生的污染具有一定耐受性，可作為一種可靠的替代方法；

3. 優(yōu)化樣本處理（如離心條件、抗凝劑選擇等）可以部分減輕分析前偏差的影響；

4. 研究鑒定出的大量蛋白質(zhì)組為進(jìn)一步的生物標(biāo)志物研究提供了豐富的資源。