類器官是能夠在體外三維培養，并表現出相應器官生物學特征的“最小系統”。雖然對于類器官的研究日趨成熟，但大家總會有這樣那樣的小困惑：為什么要用上皮細胞培養？為什么培養基的成分這么復雜？

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今天小編整理了一些關于類器官構建原理方面的問題，希望能夠對各位小伙伴有所幫助。

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Q1: 類器官培養對于起始細胞的來源有要求嗎？

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A1: 目前培養的類器官主要來源于上皮細胞，對于非上皮細胞來源的類器官培養方式還需要進一步研究。

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Q2: 類器官按照起始細胞的類型，分為幾種呢？

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A2: 常見的類器官根據起始細胞的類型，可以分為兩種：

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（1）腫瘤組織來源的腫瘤類器官；

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（2）干細胞來源的類器官，包括：多能性干細胞 (PSC) /成體干細胞 (ASC)以及誘導多能干細胞(iPSC)。

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Q3: 類器官是由單一種類細胞組成的嗎？

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A3: 類器官并不是單一細胞組成的結構，而是由具有干細胞性質的起始細胞進行分裂和分化，并將多種類型的細胞自組裝的結構，自組裝后的形態和功能與體內相應器官相似。

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Q4：在沒有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織提取的原代細胞進行3D培養嗎？

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A4：可以的。已有學者驗證過，將人結腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術組織切碎后，以梯度降溫的方式進行冷凍，最終在液氮中保存15-18個月后進行復蘇和原代細胞提取，分別對細胞進行2D和3D培養，證實了凍存對于細胞活力和生長速度均無顯著影響^【1】。

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當然，由于組織來源不同、凍存條件不同，還需要大家根據實際情況進行驗證，新鮮組織提取的細胞依然是3D培養的最佳選擇。

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Q5：類器官可以像細胞一樣進行凍存和復蘇嗎？

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A5：類器官可以凍存，通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進行凍存。

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Q6：類器官的尺寸需要進行控制嗎？

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A6：是的，主要的原因是類器官內部缺乏循環系統。

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當類器官的尺寸較大時，靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養成分的交換。因此這個結構尺寸越大，死亡的細胞就越多（如圖1）^【2】。我們在培養的過程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內。未來的類器官技術可以與血管類器官結合在一起，建立一個功能性的封閉循環系統，用以培養出更大尺寸的類器官。

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圖1. TUNEL染色表明較大尺寸的類器官中心有大量細胞死亡（綠色），比例尺為100μm^【2】

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Q7：類器官傳代的標準是什么？

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A7：類器官的傳代通常是根據培養的時間判斷。一般在7-14天時進行第一次傳代，后續則每7-10天傳代一次^【3】。

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Q8：類器官可以進行多少次傳代？

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A8：大部分類器官可以在體外連續傳代10次（>6個月），甚至有些類器官可以連續傳代20次（>12個月）并且維持原有的生長速度^【4】。

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Q9: 鑒定類器官的方法有哪些？

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A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術檢測該類器官是否表達相應的biomarker；基因測序可以鑒定所培養的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。

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Q10: 類器官是如何按照我們的意愿進行定向分化的？

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A10: 在進行類器官培養前，我們需要了解該器官在體內的發育過程，及早期發育相關的信號通路。

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以胃類器官培養為例：胃由前后腸發育而來，早期發育需要由多種信號通路共同調控。那么在體外我們需要通過添加細胞因子的方式，指導激活/抑制相應的信號通路，來達到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導細胞向向前腸分化^【5】。

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參考文獻

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【1】He, A. et al. (2020). Cryopreservation of viable human tissues: Renewable resource for viable tissue, cell lines, and organoid development. Biopreservation and Biobanking, 18(3), 222-227.

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【2】Lancaster, M. A. et al. (2013). Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature, 501(7467), 373-379.

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【3】Sheridan, M. A. et al. (2020). Establishment and differentiation of long-term trophoblast organoid cultures from the human placenta. Nature Protocols, 15(10), 3441-3463.

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【4】Beshiri, M. L. et al.(2018). A PDX/organoid biobank of advanced prostate cancers captures genomic and phenotypic heterogeneity for disease modeling and therapeutic screening. Clinical Cancer Research, 24(17), 4332-4345.

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【5】McCracken, K. W. et al. (2014). Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature, 516(7531), 400-404.

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