文章標題：Reno-Protective Effect of Low Protein Diet Supplemented With α-Ketoacid Through?Gut Microbiota and Fecal Metabolism in 5/6 Nephrectomized Mice

發表期刊：Frontiers in Nutrition

影響因子：6.59

作者單位：復旦大學附屬閔行醫院

百趣生物提供服務：非靶標代謝組學，16S

代謝組學分享—研究背景

代謝組學分享，慢性腎病(Chronic kidney disease, CKD)影響著全球近8.5億人，其發病率和死亡率都很高。經研究發現，低蛋白飲食(low protein diet, LPD)通過減輕腎小球高濾過產生氮廢物的工作狀態，延緩CKD發展。代謝組學分享，鑒于LPD存在潛在副作用，如氨基酸供應不足和營養不良，補充α-酮酸（一種必需氨基酸的無氮替代物）的LPD(LKD)被應用于延緩CKD的發展。

且研究表明，LKD在減少代謝負擔、對腎組織氧化應激的保護作用和血壓控制方面比LPD更有效。而LPD和LKD延緩CKD發展的機制尚不清楚。代謝組學分享，近年來，許多研究報道腸道菌群失調會改變宿主代謝組，并影響人類和嚙齒動物的腎功能衰竭和CKD并發癥。

膳食結構的組成和變化對腸道菌群的結構和代謝有著深遠的影響。結腸是大多數腸道菌群生長和代謝的地方，盡管5-10%的膳食氨基酸會到達結腸，但許多膳食微生物組研究通常集中在膳食纖維、脂肪和碳水化合物的影響上。關于膳食蛋白質對CKD腸道菌群和代謝的具體影響知之甚少。代謝組學分享，LKD是CKD治療的基石，而LKD-微生物代謝相互作用在CKD發病和治療中的機制作用仍不清楚。因此，作者對5/6腎次全切除術(5/6Nx)誘導的CKD小鼠采用不同的喂養方法，探討了LKD和LPD對腸道菌群和糞便代謝的影響。

代謝組學分享—研究設計

見圖1A，其中Sham組為假手術組，即腎臟沒有被切除的小鼠組；NPD組為正常蛋白質飲食的5/6Nx小鼠組；LPD組為低蛋白質飲食的5/6Nx小鼠組；LKD組為補充α-酮酸的低蛋白質飲食的5/6Nx小鼠組。

代謝組學分享—研究結果

1. LKD緩解了5/6Nx小鼠的腎功能衰竭 與Sham組相比，NPD組的體重明顯減輕（圖1B），而LPD組和LKD組似乎并沒有體重減輕。由圖1C-E可知，NPD組中24小時尿蛋白、血清肌酐(SCR)和血尿素氮(BUN)的水平顯著高于Sham組的結果，證實CKD模型成功（所有p<0.0001）。與NPD組相比，LKD組中的SCR水平顯著降低，但在LPD組中沒有改變。與NPD組相比，LPD組的BUN水平均顯著降低。代謝組學分享，此外，Sham組小鼠腎臟組織中腎小球和腎小管結構正常，小鼠腎臟病理改變結果與腎功能改變結果一致（圖1F）。其中，CKD組均有不同程度的腎間質纖維化、大量淋巴細胞浸潤、腎小管腫脹、壞死。代謝組學分享，與NPD組相比，LPD組和LKD組腎組織損傷程度明顯改善，淋巴細胞浸潤和腎小管病變明顯減少，尤其是LKD組。

圖1

1. LKD改善5/6Nx小鼠的腎纖維化和炎癥 為了進一步驗證LKD和LPD是否可以延緩5/6Nx誘導的腎功能衰竭的發展，作者進行了Masson、Sirius red染色和α-SMA抗體的免疫組織化學觀察CKD小鼠的腎纖維化程度（圖2A-C）。結果表明，LKD和LPD顯著改善了CKD小鼠的纖維化程度，尤其是LKD。代謝組學分享，由于CKD通常伴有微炎癥狀態，作者檢測了血清中的三種炎癥因子（IL-6、TNF-α和IL-1β）以評估炎癥水平（圖2D-F）。與Sham組相比，NPD組的IL-6、TNF-α和IL-1β均顯著增加，表明微炎癥狀態。與NPD組相比，LPD和LKD的IL-6、TNF-α和IL-1β均顯著降低。此外，LKD組中的IL-6顯著低于LPD組，表明LKD組具有更好的抗炎能力。

圖2

1. 5/6Nx和LKD對腸道菌群的影響

鑒于5/6Nx和不同飲食會對腸道菌群產生影響，作者探索了不同組間小鼠腸道菌群的結構和差異。如圖3B所示，NPD組的Chao1和Shannon均顯著低于sham組，且Chao1顯著低于LKD組。這表明5/6Nx會降低腸道菌群的豐富度和多樣性，而LKD減弱了5/6Nx引起的腸道菌群豐富度降低的影響。代謝組學分享，非度量多維尺度分析(NMDS)分析（圖3C）顯示，Sham組與NPD組、LPD組和LKD組顯著分離，相距較遠。

LPD組和LKD組的聚類圈較近且遠離sham組和NPD組。這表明，與5/6Nx相比，改變飲食方式對腸道菌群整體結構的影響更大。NPD組與Sham組相比，厚壁菌門的數量增加且厚壁菌門與擬桿菌門的比例（F/B）顯著高于Sham組；而LKD組與NDP組相比，厚壁菌門的數量減少且LKD組的F/B比率低于NPD組（圖3D-E）。這些結果表明，四組小鼠的腸道微生物群在多樣性和結構上都存在差異，且LKD組可能通過增加微生物豐富度和降低F/B比來改善5/6Nx引起的菌群失調。

圖3

1. 5/6Nx對糞便代謝組的影響 對糞便進行代謝組學檢測分析發現，5/6Nx顯著改變了糞便代謝物的代謝模式（圖4C），并且這些差異代謝物主要是有機酸及其衍生物（30.1%）、脂質和類脂分子（24.2%）和有機雜環化合物（22.3%）。代謝組學分享，為了探究差異代謝物的功能意義，通過代謝通路富集分析，發現差異代謝物主要富集在各種氨基酸的生物合成與代謝通路（圖4D）。

圖4

1. LKD對5/6Nx小鼠糞便代謝組的影響 由于LKD對5/6Nx的治療效果優于LPD，作者進一步分析了LKD組、NPD組和LPD組糞便代謝物的差異，以探討其作用機制。代謝組學分享，結果表明，與NPD組相比，LKD組的糞便代謝物顯著不同，并且這些差異代謝物主要由脂質和類脂分子（21%）、有機酸及其衍生物（20%）、有機雜環化合物（20%）、有機氮化合物（8.7%） 等組成（圖5C）。LKD組和LPD組之間的差異代謝物主要由脂質和類脂分子（34.3%）、有機雜環化合物（23.2%）、有機酸及其衍生物（17.1%）、有機氮化合物（8%）等組成（圖6C）。 LKD組和NPD組之間的差異代謝物主要富集在各種氨基酸的代謝通路（圖5D），而LKD組和LPD組之間的差異代謝物主要富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路（圖6D）。

圖5

圖6

1. 鑒定與LKD相關的關鍵OTU和代謝物 圖7A-D顯示了差異豐度的操作分類單元(OTU)及其數量。圖7E表明，有13個OTU為LKD特異性差異OTU，可延遲5/6Nx誘導的腎功能衰竭。代謝組學分享，圖7F表明，有五種常見的通路被確定為與LKD延緩5/6Nx誘導的腎功能衰竭相關的的關鍵通路，分別是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；甘油磷脂代謝；鞘脂代謝；維生素B6代謝和嘌呤代謝。

圖7

1. 多組學分析揭示了LKD、腸道菌群和糞便代謝組之間的關聯

為了進一步探索LKD的機制，作者進行了多組學分析，將關鍵的糞便代謝物與關鍵OTU和CKD相關參數（腎功能和炎癥因子）進行了關聯分析（圖8A）。由圖可知，一些關鍵OTU與糞便代謝物顯著相關，這表明LKD誘導的腸道菌群的改變可能會影響糞便代謝。

由圖8B桑基圖中可知，s_Parabacteroides_sp_CT06(OTU_47),s_Mucispirillum_sp_69(OTU_926),g_Akkermansia(OTU_131)和g_Lachnoclostridium(OTU_63)是影響糞便代謝組的四種主要生物標志物。PC(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/16:0)（參與甘油磷脂代謝）與CKD相關參數呈負相關。代謝組學分享，參與嘌呤代謝的黃嘌呤和次黃嘌呤與CKD呈正相關。吡哆醇、吡哆醛和4-吡哆酸（參與維生素B6代謝）與CKD呈負相關。脫氫鞘氨醇和鞘氨醇（參與鞘脂代謝）與CKD呈正相關。L-苯丙氨酸和L-酪氨酸（參與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成）與CKD呈正相關。這些結果表明，參與甘油磷脂、嘌呤、維生素B6、鞘脂、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的特定代謝物以及與LKD相關的微生物與CKD的改善相關。

圖8

代謝組學分享—總結

作者將小鼠5/6腎切除后給予正常蛋白飼料(NPD)組、低蛋白飼料(LPD)組和低蛋白飼料加α-酮酸(LKD)組，8周后，采集血液、腎組織和糞便進行生化分析、組織學、腸道菌群的16S rRNA序列和非靶標糞便代謝分析。代謝組學分享，得出以下結果：

（1）LKD和LPD都減輕了5/6腎切除小鼠的腎衰竭和纖維化以及炎癥狀態，尤其是LKD。

（2）在腸道微生物組方面，LKD顯著改善了5/6Nx引起的菌群失調。

（3）5/6Nx和LKD顯著改變了糞便代謝組。

（4）參與甘油磷脂、嘌呤、維生素B6、鞘脂、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的特定代謝物以及與LKD相關的微生物與CKD的改善相關。

總的來說，LKD在延緩5/6腎切除術所致CKD腎功能衰竭方面的效果優于LPD，這可能與影響腸道微生物組和糞便代謝組的調節有關。