由于在誘導間充質干細胞(MSCs)向軟骨和骨室的空間、定向和可控分化方面存在困難，分級骨軟骨單位的再生具有挑戰性。新興的類器官技術為骨軟骨再生提供了新的機會。利用特制的微凝膠產生自組裝軟骨類器官的新方法為推進組織工程領域提供了一種非常有前途的途徑。

軟骨損傷中軟骨和軟骨下的結構和功能修復仍然是一個主要的科學和臨床挑戰，由于它們不同的愈合能力和組織整合特性、軟骨和骨之間的密切相互作用、沿結構軸的動態梯度變化以及不同的組織發育階段。

轉錄組測序 mRNA-seq

技術服務由伯豪生物提供

1. 定制微凝膠，以及在定制微凝膠的軟骨和成骨分化

為了給MSC在軟骨和成骨分化提供合適的微環境，將透明質酸(HA)和羥基磷灰石(HYP)分別加入到基于凝膠化的前體溶液中，經冷凍、鋪板、洗滌和凍干后形成CH-微凝膠和OS-微凝膠。將MSCs接種到定制的CH-微凝膠和OS-微凝膠中，然后分別在成軟骨和成骨誘導培養基中培養7天，形成預分化的負載細胞的定制微凝膠。預分化的軟骨和成骨微凝膠依次沉積成兩層，通過自組裝形成骨軟骨類器官。

2. 將定制的微冷凍凝膠自組裝成骨軟骨類器官

將CH-微凝膠和OS-微凝膠分別進行7天的軟骨和成骨分化誘導，然后將預分化的微凝膠移液到4 mm長的網狀框架中，接著在混合骨軟骨誘導培養基中培養7天(軟骨分化:成骨分化= 1:1)。在試管內預分化微凝膠自組裝成軟骨類器官。

3. 定制的微冷凍凝膠直接決定了MSC的命運

在軟骨形成誘導7天后，比較在對照微凝膠和CH-微凝膠中生長的MSCs。共發現4408個差異表達基因(DEGs，包括1615個下調基因和2793個上調基因）。為了更好地了解DEGs在軟骨再生中的GO功能，將其分為:軟骨細胞調節和免疫調節。軟骨細胞增殖的GO項顯著上調，免疫反應相關下調，如對白細胞介素-1的反應、白細胞遷移、炎癥反應的調節和T細胞介導的免疫等。KEGG富集分析顯示，有3條通路上調，包括hedgehog、rap1和p53信號通路，還有8條與免疫調節和軟骨細胞肥大相關的通路下調，包括TGF-β、PI3K-Akt和MAPK信號通路。進一步探索SOX9的GSEA，發現在骨重塑、骨吸收、膠原分解代謝過程、成纖維細胞增殖負調控、I型干擾素介導的信號通路負調控等方面均有下調，在急性炎癥反應和t細胞穩態正調節。

在成骨方面，在成骨誘導7天后，比較了在對照微冷凍液和OS微冷凍液中生長的MSCs。分析共2158個下調的DEGs和3213個上調的DEGs。GO分析發現10個上調的GO術語與成骨細胞分化、骨化、骨發育、骨生長和骨礦化有關。PPI分析顯示了骨再生相關通路的顯著聚集，如軟骨細胞分化、軟骨發育和TGF-β受體信號通路。KEGG分析顯示，與骨發育(包括PI3K-Akt、FoxO、TGF-β、MAPK和Wnt信號通路)和免疫調節(mTOR、TNF和IL-17信號通路)相關的通路顯著上調，而凋亡相關的p53信號通路顯著下調。GSEA分析顯示，COL1A在MAPK活性的激活、骨細胞發育、TGF-β產生和血管相關平滑肌收縮中上調，在巨噬細胞遷移的調節中下調。RUNX2在脂肪酸β氧化的調節和對TGFβ的反應中上調，在單核細胞分化，正向調節破骨細胞分化，正向調節調節性t細胞分化中下調。

4. 自組裝骨軟骨類器官對體內骨軟骨缺損的影響

采用比格犬股骨缺損模型，研究了預分化定制微冷凍凝膠自組裝形成的軟骨類器官對體內治療骨軟骨缺損的影響。注釋定制的微凝膠后立即完全填充缺損，隨后原位自我定向組裝成軟骨類器官。術后6個月，對照組的比格犬表現出明顯的跛行，而微凝膠治療組表現出步態的明顯改善，盡管有輕度的殘余跛行。骨軟骨類器官干預組表現出標準步態。MRI 圖像（紅色箭頭表示修復組織的區域）顯示術后3個月，所有缺損組均未被新組織完全填充，軟骨下骨也出現一定程度的炎癥和水腫。在對照微凝膠和軟骨類器官組中觀察到更連續的修復組織信號。在12個月時，軟骨下骨的水腫在未治療的對照組和對照組微凝膠組中仍然明顯，但在軟骨類器官組中幾乎完全消失。此外，缺損僅在軟骨類器官組中被完全填充，顯示出與周圍正常軟骨相比具有高度相似性的光滑和均勻的修復組織。