J Gastroenterol｜腸道纖維化新希望：脂肪間充質干細胞小胞外囊泡如何借助MFGE8靶向FAK/Akt發揮抗纖維化作用
文章標題：Small extracellular vesicles derived from adipose mesenchymal stem cells alleviate intestinal fibrosis by inhibiting the FAK/Akt signaling pathway via MFGE8
發表期刊：Journal of Gastroenterology
影響因子：6.9
客戶單位：中山大學附屬第六醫院
百趣提供服務：Label free定量蛋白質組學
研究背景
腸纖維化是克羅恩病(Crohn’s disease, CD)最常見和最嚴重的并發癥之一，越來越多的研究表明，脂肪間充質干細胞衍生的小細胞外囊泡(adipose mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles, AMSC-sEVs)可以緩解腎纖維化、肝纖維化等，但其治療腸纖維化的潛力尚不確定。因此，本研究旨在確定AMSC-sEVs對腸纖維化的治療作用，并確定這些作用的機制。
研究結果
1.sEVs對AMSCs抗纖維化作用至關重要
為探究sEVs是否作為AMSC抑制腸道纖維化的旁分泌介質，收集了兩種不同的培養基，即條件培養基(Conditioned medium, CM)和不含sEV的條件培養基(Conditioned medium without sEVs, RCM) （圖1A），然后將它們分別與肌成纖維細胞共培養48小時。CM能降低TGF-β1刺激的成纖維細胞中膠原蛋白I表達，抑制腸道纖維化，而RCM可逆轉此效果，表明AMSCs通過分泌sEVs發揮抗纖維化作用（圖1B-C）。此外，蛋白質印跡結果顯示，用AMSC-CM處理的小鼠的膠原蛋白I表達低于模型組，但RCM逆轉了這一變化（圖1G）。這些結果表明AMSC-sEVs可能在體外和體內減輕腸道纖維化。使用透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析和蛋白質印跡法對AMSC-sEVs進行表征，發現AMSC-sEVs呈典型形態，粒徑43-100nm，符合sEV鑒定標準。
圖1. AMSC-CM在體外和體內均能抑制腸纖維化
2.AMSC-sEVs抑制成纖維細胞活化
共聚焦圖像顯示AMSC-sEVs位于肌成纖維細胞的細胞質中，表明AMSC-sEVs可以被肌成纖維吞噬（圖2A）。為了研究AMSC-sEVs對抑制肌成纖維細胞活化的影響，用TGF-β1刺激的人腸成纖維細胞(Human Intestinal Fibroblast, HIFs) 和CCD18co進行處理；與模型組相比，無論sEVs的濃度如何，AMSC-sEVs都能抑制膠原蛋白I的表達，濃度達到 20μg/ml時效果最明顯（圖2B-E）。因此，選擇20μg/ml的AMSC-sEVs用于后續的體外實驗。此外，AMSC-sEVs阻止了TGF-β1誘導的成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，隨著這種轉化的抑制，COL1A1和MMP2的表達降低（圖2D-G）。
圖2. AMSCs-sEVs消除了成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉變
3.AMSC-sEVs可逆轉兩種腸道纖維化模型中的纖維化
為追蹤輸注的AMSC-sEVs在體內的生物分布，將CM-DiR標記的AMSC-sEVs腹腔注射到2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)誘導的小鼠體內。在注射sEVs后24和48小時對小鼠進行體內熒光成像，并在小鼠處死后新鮮解剖并收集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和結腸用于后續測試，發現AMSC-sEVs主要分布在結腸（圖3A）。
為了測試AMSC-sEVs的效力，我們將其（每只小鼠每天30μg，連續7天）應用于右旋糖酐鈉鹽(Dextran sodium salt, DSS)誘導的腸道纖維化小鼠模型中。在DSS模型中，AMSC-sEVs顯著減輕了結腸縮短和重量/長度比，降低了纖維化評分（圖3B-E）。通過蛋白質印跡法評估的膠原蛋白I水平以及通過RT-qPCR測量的纖維化指數（COL1A1和MMP2）在模型小鼠的結腸中在AMSC-sEV治療后也顯著降低（圖3F-G）。
圖3. 治療性AMSC-sEVs應用改善了慢性DSS誘導模型中的腸纖維化
4.AMSC-sEVs的蛋白質組學分析
為鑒定AMSC-sEVs中的穩定蛋白質，使用SwissProt數據庫在sEVs中鑒定出357種蛋白質，其中10種蛋白質的表達倍數變化在1.2或以下。我們關注抗纖維化相關蛋白質，并選擇MFGE8、FBLN1和 Rac1進行進一步研究。此外，發現FAK和PI3K-Akt信號通路與AMSC-sEVs中蛋白質相關的信號通路最為密切相關。
5.MFGE8在體外和體內減少腸纖維化
如圖4A所示，MFGE8以劑量依賴的方式有效降低了TGF-β1存在下HIFs中膠原蛋白I的水平。然后使用500 ng/ml MFGE8進行后續的體外實驗，證明了MFGE8可以有效降低HIFs和CCD18co中纖維化生物標志物的表達。
此外，為了探索MFGE8在體內的作用，將MFGE8腹腔注射到實驗性小鼠結腸纖維化模型中，發現MFGE8給藥顯著減輕了腸道纖維化，表現為結腸延長和結腸重量/長度比降低（圖4C-D）。與模型組相比，MFGE8顯著降低了小鼠結腸的內鏡和纖維化評分（圖4E-F）；在另一種TNBS誘導的小鼠腸道纖維化模型中，觀察到MFGE8的類似作用，進一步證實了MFGE8在減輕腸道纖維化中的作用。
圖4. MFGE8抑制DSS誘導的小鼠模型中成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，逆轉終末期纖維化
6.MFGE8沉默的sEVs不能減輕腸道纖維化
為了進一步確定MFGE8是否參與AMSC-sEVs對腸道纖維化的影響，在AMSCs中敲除MFGE8。發現與AMSC-sEV siControl處理的細胞相比，膠原蛋白I蛋白產生增加（圖5A-C），COL1A1和MMP2 mRNA表達增加（圖5B-D）。此外，將AMSC-sEVssiMFGE8腹腔注射到DSS誘導的腸道纖維化小鼠模型中，發現與AMSC-sEV siControl相比，AMSC- sEVssiMFGE8的應用導致內鏡評分和纖維化評分增加（圖5F-G）。在TNBS誘導的腸道纖維化模型中重復了實驗，得到了類似的結果，進一步證實了AMSC-sEVs通過MFGE8發揮抗腸道纖維化作用。
圖5. AMSC-sEVs通過體內外遞送MFGE8緩解腸纖維化
7.AMSC-sEVs轉移的MFGE8通過抑制FAK/Akt信號通路減輕HIF的纖維化
KEGG通路分析揭示了sEV相關的FAK通路的改變，該通路參與了皮膚、肺和腎臟中的各種纖維化過程（圖6A）。此外，對于HIFs，TGF-β1激活了FAK/Akt通路，增加了p-FAK和p-Akt的磷酸化。同樣，在DSS誘導和TNBS誘導的腸道纖維化模型小鼠中證實了MFGE8沉默導致的FAK/Akt通路重新激活。因此，我們推測AMSC-sEV siControl通過抑制FAK/Akt信號通路來治療腸道纖維化。
圖6. AMSC-sEVs通過體內外遞送MFGE8緩解腸纖維化
研究結論
本研究驗證了AMSC-sEVs在體內外可減輕腸纖維化，且可能通過MFGE8抑制FAK/Akt信號通路實現，為臨床治療長纖維化提供理論依據。
圖7. AMSC-sEV抗腸纖維化的可能機制