Sci. Adv. (IF=12.5)｜揚州大學徐辰武教授團隊重大發現：玉米側根轉錄因子bZIP89為分子育種提供新靶點！
英文標題：Natural variation in a cortex/epidermis-specific transcription factor bZIP89 determines lateral root development and drought resilience in maize
中文標題：皮層/表皮特異性轉錄因子bZIP89的自然變異決定玉米側根發育和干旱適應性
發表期刊：Science Advances
影響因子：12.5
文章簡介
側根(Lateral roots，LRs)的分支生長對植物獲取水分和養分至關重要，最終決定著植株的整體表現和產量。然而，作物側根發育的轉錄調控機制及其在抗逆性中的作用仍鮮有研究。近期，揚州大學農學院徐辰武教授團隊在Science Advances期刊發表題為“Natural variation in a cortex/epidermis-specific transcription factor bZIP89 determines lateral root development and drought resilience in maize”的研究論文。該研究旨在整合多組學數據，鑒定及克隆了調控玉米側根發育和耐旱的關鍵轉錄因子ZmbZIP89，并揭示了其調控側根發育和耐旱的分子機制，不僅深化了我們對側根發育分子機制的理解，也為培育抗逆性作物提供了潛在的基因靶點。
技術路線
研究結果
1. 玉米多樣性群體的根表型和側根相關基因鑒定
該研究對357份玉米材料中具有代表性的側根材料進行Bulk RNA測序，質控后共保留21697個基因進行轉錄組全關聯分析(TWAS)，用于鑒定其與總側根長度(LRL)之間的關聯，結果顯示647個基因與LRL顯著相關（圖1A）。GO富集分析顯示，這些基因顯著富集于細胞壁組織或生物發生以及ROS代謝過程（圖 1B）。基于357個自交系的基因表達譜，共構建37個轉錄因子與647個潛在共調控基因的網絡關聯，鑒定到9327個轉錄因子-靶基因對（圖1C），其中連接度最高的9個轉錄因子（如DBB11、THX18）各涉及超過400個基因。
圖1. LRL的TWAS
2. 玉米幼苗初生根的單細胞轉錄組
為高分辨率研究玉米初生根的細胞異質性和基因表達的空間模式，取參考基因型B73的100株幼苗初生根的三個代表性區域（圖2A），混合酶解生成原生質體，進行單細胞轉錄組分析，結果在12190個細胞中共檢測到29266個表達基因。降維聚類分析后，細胞被分為21個轉錄不同的簇（圖2B），進一步分析后，21個簇被注釋為10個不同的細胞群（圖2B）。
基因富集分析顯示，647個側根長度(LRL)相關基因主要富集于C0（皮層）和C4（表皮）細胞簇，C6、C14簇有少量富集（圖2C）；C0、C4簇含有的LRL 相關基因數量最多，分別為128個和146個（圖2E）。GO分析顯示：C0、C4簇中的LRL相關基因顯著參與植物型細胞壁組織或生物發生、過氧化物酶活性及ROS代謝過程。解卷積計算357個玉米自交系bulk RNA-seq數據的細胞分數后發現，LRL與C0、C4等細胞簇呈顯著正相關，與C9、C2等呈負相關（圖2D），提示表皮和皮層中的細胞類型特異性基因可能在玉米根長調控中起重要作用。
圖2. 表皮和皮質中富集的LRL相關基因
3. ZmbZIP89是側根長度的關鍵調控因子
在37個與LRL相關的轉錄因子中，ZmHB49、ZmbZIP89等8個轉錄因子主要在C0或C4簇表達，且分別調控LRL相關靶基因；AUCell評分顯示除COL18外，其余7個轉錄因子-靶基因調控單元均主要在C0、C4簇表達。
用XGBoost算法對C0、C4簇中8個轉錄因子進行優先級排序，ZmbZIP120、ZmbZIP89、ZmCOL18的特征重要性分數最高（圖3A）；結合轉錄因子的靶基因數量，確定ZmbZIP89為C0、C4簇中調控LRL的關鍵轉錄因子（圖3A-B）。
為驗證上述結果，構建ZmbZIP89過表達(OE)株系，幼苗期表型分析顯示，與WT相比，ZmbZIP89-OE植株的LRL顯著增加約30%，總根長、初生根長等也顯著增加（圖3C-D）；且OE植株的初生根平均側根長(APLRL)、側根密度(PLRD)顯著高于WT（圖3F），表明ZmbZIP89正向調控側根發育。
圖3. ZmbZIP89正向調控表皮和皮質中的LRL
4. ZmbZIP89直接調控ZmPRX47表達
研究人員通過DNA親和純化測序(DAP-seq)篩選ZmbZIP89的直接結合基因，結合scRNA-seq數據提取表皮(C4)、皮層(C0)中與ZmbZIP89共表達的基因，整合TWAS、DAP-seq、scRNA-seq及共表達分析結果，鑒定到86個可能參與側根發育調控的ZmbZIP89靶基因（圖4A）；GO富集顯示，這些靶基因顯著參與植物型細胞壁組織或生物發生、ROS代謝過程，包含ZmPRX47等ROS相關基因（圖4B）。表型與表達驗證顯示，ZmbZIP89 OE株系的根過氧化物酶(POD)活性顯著高于WT（圖3G），且靶基因ZmPRX47的表達顯著上調，ZmbZIP89與ZmPRX47的表達水平高度相關（圖4A-C）。
雙熒光素酶(LUC)報告基因實驗顯示，ZmbZIP89可顯著激活ZmPRX47啟動子驅動的LUC表達（圖4E）；酵母單雜交(Y1H)實驗證實，ZmbZIP89能與ZmPRX47啟動子-322至-212 bp區域結合（圖4F）；電泳遷移率變動分析(EMSA)顯示，重組ZmbZIP89-His可結合含CACGT基序的ZmPRX47啟動子探針，但不能結合突變探針（圖4G），這些結果表明ZmbZIP89可直接激活ZmPRX47轉錄。
圖4. ZmbZIP89在表皮和皮質中全基因組直接靶點的鑒定
5. ZmPRX47調控玉米ROS產生和側根發育
整合TWAS與單細胞分析顯示，ZmPRX47特異性表達于皮層和表皮，且其表達水平與LRL相關（圖5A）。研究人員通過CRISPR-Cas9技術生成兩個獨立ZmPRX47突變體。表型分析顯示，與WT相比，ZmPRX47突變體的LRL減少約21%，APLRL減少21.2%-24.1%，PLRD減少17.1%-23.3%（圖5B-E）；且突變體的POD活性顯著低于WT（圖5F）。此外，側根原基區域的ROS信號在突變體中比WT更強（圖5G-H），表明ZmPRX47可能通過調控ROS穩態在側根發育中起關鍵作用。
圖5. ZmPRX47正向調控表皮和皮質中的LRL
6. ZmbZIP89-ZmPRX47調控玉米耐旱性
耐旱實驗顯示，培養箱干旱條件下ZmbZIP89-OE系耐受性顯著強于WT，干旱處理后，存活率更高（圖6A-C）；且OE株系的LRL、生物量顯著高于WT（圖6B-D）。此外，干旱脅迫下，ZmbZIP89-OE株系的葉片光合速率(PS)、氣孔導度(SC)、蒸騰速率(TR)及水分利用效率(WUE)均顯著高于WT（圖6E）。
單獨ZmPRX47實驗顯示，干旱條件下，與WT相比，突變體的存活率、LRL、生物量、PS、SC、TR、WUE顯著降低（圖6F-J）。綜上，ZmbZIP89-ZmPRX47模塊系統性影響玉米耐旱性及干旱脅迫恢復能力。
圖6. ZmbZIP89和ZmPRX47轉基因玉米的抗旱性
7. ZmbZIP89基因3'UTR自然變異賦予側根發育和耐旱性
164份重測序玉米自交系中，關聯分析鑒定到10個與ZmbZIP89表達顯著相關的變異，其中2個為3'UTR SNP（圖7A）。該區域6個變異完全連鎖不平衡，形成兩個單倍型組（Hap1、Hap2，圖7B）。攜帶Hap2的種質ZmbZIP89表達水平顯著高于Hap1，且LRL更長（圖7C）。
耐旱性分析顯示，Hap2自交系的地上部干重(SDW)、PS、WUE高于Hap1自交系（圖7D-G）。瞬時轉錄激活實驗顯示，Hap2的3'UTR 轉錄活性顯著強于Hap1（圖7H）；本氏煙草葉片實驗中，ZmbZIP89Hap2 mRNA降解速度慢于Hap1，與玉米自交系根中mRNA穩定性差異一致（圖7I），表明3'UTR自然變異影響ZmbZIP89表達。此外，189份原始野生玉米品種中，ZmbZIP89 3'UTR抗旱等位基因頻率較低（圖7J）；而507份玉米自交系中該等位基因頻率顯著升高，這些結果表明在現代育種進化過程中，這些等位基因的被選擇作用較強。
圖7. ZmbZIP89的3‘UTR自然變異賦予了強健的側根發育和增強的耐旱性
研究結論
本研究揭示了一個決定玉米根發育的重要轉錄因子，為通過基因工程提高作物干旱適應性以實現可持續農業提供了潛在應用價值。未來研究需要闡明影響根生理和發育狀態的基因-基因相互作用的空間模式，這將有助于系統解析谷物作物中特定根系性狀如何介導非生物脅迫抗性的作用機制。
單細胞轉錄組測序：是在單個細胞水平進行高通量測序的技術，能夠有效解決細胞異質性，有助于發現新的稀有細胞類型，深入了解細胞生長過程中的表達調控機制。利用微流控系統通過序列標簽（barcode和UMI）區別群體中的不同細胞和轉錄本，獲得單細胞水平的基因表達譜。
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快樂小包子 撰文
Peng 校稿