WS主要由WFS1的致病變異引起，Wolfram基因(WFS1)編碼一種在內質網膜上具有9個跨膜結構域的蛋白，該蛋白在胰島β細胞和大腦中高度表達。對WS患者胰腺的分析表明，胰島β細胞存在選擇性損失。位于內質網膜上的WFS1在蛋白質從內質網轉運到高爾基體中起作用，它直接與包括胰島素原在內的一系列囊狀貨物蛋白相互作用。WFS1缺陷小鼠在葡萄糖刺激下表現出胰島素加工減少和胰島素分泌受損。胰島β細胞中WFS1的功能喪失導致胰島β細胞死亡后內質網應激增加和未折疊蛋白反應(UPR)的激活。這些發現表明WFS1缺陷胰島β細胞的細胞應激增加。異常應激顆粒的形成在多種疾病中起著關鍵作用，真核起始因子2 (eIF2)在α亞基上的磷酸化可通過包括PERK在內的四種不同的激酶啟動ISR，從而誘導應激下UPR的激活。一旦ISR被觸發，限制了AUG啟動的mRNA翻譯，誘導應激顆粒的組裝和細胞死亡。因此WFS1可能控制ISR和隨之而來的應激顆粒形成。

由于缺乏適當的人體模型，對WS發病機制的了解受到限制。為了闡明WFS1缺乏導致胰島β細胞衰竭的機制，通過hESCs衍生的胰島來表征WFS1缺乏作為人胰島β細胞衰竭模型。結果表明，WFS1缺陷驅動胰島β細胞命運進入應激軌道，導致功能失敗。使用ISR抑制劑ISRIB治療可增加胰島的比例并減輕細胞凋亡。研究為WS糖尿病胰島β細胞紊亂提供了機制見解，并提出了一種潛在的ISRIB治療方法。

scRNA-seq；胰島β細胞；Wolfram syndrome

我們利用含有WFS1缺陷的sc -胰島作為體外逐步分化hESCs分化的疾病模型（圖1A），同時，利用CRISPR/Cas9敲除策略建立了WFS1敲除hESCs報告細胞系(WFS1−/−)。采用qRT-PCR檢測ES期到胰島期WFS1的表達水平，我們發現WFS1在WT細胞系的分化過程中逐漸表達，這與報道的WFS1在人原代胰島β細胞中的高表達一致（圖1B）。對WT和WFS1−/−胰島進行scRNA-seq分析（圖1C）。WFS1−/−胰島中WFS1的表達大大減少，證實了WFS1的完全敲除（圖1D）。無監督聚類分析確定了WT和WFS1−/−中8個不同cluster（圖1E），包括β細胞(表達INS、PCSK1和G6PC2)、α細胞(表達GCG)、δ細胞(表達SST)、ε細胞(表達GHRL)、胰腺祖細胞(表達SOX9)、增殖細胞(表達MKI67)、EC細胞(表達FEV)和多激素內分泌細胞(共表達GCG和INS)（圖1F）。

2. 擬時序分析揭示了應激和成熟的β細胞亞群

為了研究WFS1在胰島β細胞異質性中的功能，將所有合并的胰島β細胞重新聚類為兩個主要的β細胞亞群（圖2A）。我們根據top上調基因鑒定了這兩個亞群，并將其定義為成熟β細胞和應激β細胞。成熟β細胞的特點是高表達成熟胰島β細胞標志物，如INS、CHGA、G6PC2和PCSK1，而應激β細胞則高表達應激相關標志物，如XBP1、ATF4、ATF6、DDIT3、HERPUD1、EIF2AK1、EIF2AK2和EIF2AK4（圖2B）。我們共同揭示了成熟β細胞和應激β細胞兩個亞群的異質性。此外，通過使用Monocle擬時序分析在胰島β細胞中發現了兩個不同的分支（圖2C）。通過分子動力學來區分這兩個分支，基因表達動態分析主要集中在前500個差異表達基因上（圖2E）。我們發現，應激相關標記在1分支上高表達，如ATF4和JUN，而胰島β細胞身份和成熟標記在2分支上高表達，如INS、INS- igf2、CHGA和CDKN1C。基于以上特征，我們推斷1分支為應激狀態，2分支為成熟狀態(圖2C)。胰島β細胞總分支為兩種終末分化的細胞類型。大多數應激β細胞位于1分支(應激分支)的末端，與應激β細胞群一致(圖2D)。同時，我們評估了兩個命運分支中與胰島β細胞標志物和應激相關標志物相關的基因表達模式。WFS1沿成熟分支高表達，表明WFS1的功能與β細胞成熟相關。而ATF4、G3BP1和ATF6的表達沿脅迫分支升高，但沿成熟分支明顯降低(圖2F)?？傊?，通過單細胞轉錄組學分析，胰島β細胞的組成被鑒定為兩個不同的亞群，包括成熟和應激β細胞，具有兩種不同的命運軌跡。

3. WFS 1缺乏導致β細胞進入功能成熟缺乏的應激分支

值得注意的是，WFS1−/−胰島β細胞主要處于應激狀態。分支沿擬時序向成熟分支方向停滯（圖3A）。接下來，我們評估了WT和WFS1−/−胰島β細胞在三個細胞命運分支中的比例(圖3B)。WT和WFS1−/−胰島β細胞分別占分支前細胞總數的58.6%和41.4%。在成熟分支中，WT細胞的比例達到86.5%，而在應激分支中，WFS1−/−細胞的比例占總細胞的92.3%(圖3B)，這與WFS1−/−SCislet β細胞向成熟分支的停滯軌跡一致。同時，我們對WT和WFS1−/−胰島β細胞的轉錄組學變化進行了更深入的分析，以檢測分子變化。其中有2701個上調基因和446個下調基因(圖3C)。與胰腺β細胞成熟和功能相關的基因，如INS、NKX6.1、PCSK1和CDKN1C在WFS1−/−胰島β細胞中下調，細胞應激相關基因如ATF4、JUN、ROCK2和HSP90B1在WFS1−/−sc -胰島β細胞中上調(圖3C，3D)。相比之下，我們對scRNA-seq數據的分析顯示，WFS1−/−胰島β細胞表現出缺乏成熟的應激細胞命運。為了驗證這一點，我們在兩種細胞中進行了GSIS實驗。葡萄糖刺激后與WT相比，WFS1−/−胰島素分泌明顯減少(圖3E, F)。并且在WFS1−/−胰島中測量每個細胞的胰島素含量，結果顯示與WT sc -胰島相比，細胞內胰島素含量顯著降低(圖3E, G)。我們的結果表明，WFS1是促進β細胞走向成熟軌跡所必需的。

4. WFS 1缺乏誘導β細胞中的ISC

為了確定調節WFS1−/−胰島β細胞功能衰竭的信號通路，對胰島β細胞進行了GSEA分析，并確定了富集程度最高的通路。在WFS1−/−胰島β細胞中，與細胞應激反應相關的如PERK和HSP90在通路富集分析的前25條上調通路中顯著富集(圖4A)。為了進一步驗證WFS1−/−胰島β細胞中的下調翻譯，我們比較了eIF2相關基因的表達。WFS1−/−胰島β細胞內的差異基因中有54個與eIF2信號通路相關被富集(圖4B)。eIF2信號通路相關基因相對表達變化對比熱圖顯示，75%基因下調，表明ISR激活(圖4C)。當翻譯起始被應激反應抑制時，就會形成應力顆粒。WFS1−/−胰島β細胞內的差異基因中有21個與核心應激顆?；蛳嚓P被富集(圖4B)。值得注意的是，21個與核心脅迫顆?；蛳嚓P的基因，其中包括所有7個被描述為脅迫顆粒組裝“必需”的基因(圖4D)。綜上所述，我們的結果表明，WFS1缺失激活胰島β細胞的ISR，并導致翻譯的整體衰減。為了進一步驗證ISR在WFS1−/−胰島β細胞中的激活作用，我們檢測了ISR相關基因的表達。與WT相比，WFS1−/−胰島β細胞中ISR相關基因的表達高度增加(圖4E)。通過WB檢測PERK/eIF2信號通路關鍵因子的表達水平，發現與WT相比，WFS1−/−胰島β細胞中eIF2α的磷酸化水平顯著升高，PERK和ATF4蛋白水平也顯著升高(圖4F，G)。同時，我們采用免疫印記法檢測應激顆粒中必需成分G3BP1的表達。與WT相比，WFS1−/−胰島β細胞應激顆粒平均強度顯著升高(圖4H，I)。

5. ISR抑制劑逆轉胰腺β細胞衰竭

為了研究抑制ISR是否可以用于治療WS的胰腺β細胞衰竭，使用ISR抑制劑ISRIB在細胞水平進行驗證(圖5A)。與對照相比，經ISRIB處理的WFS1缺陷胰島中G3BP1的平均強度顯著降低(圖5B，C)。由于活化的ISR抑制蛋白合成，我們通過OPP標記進行新生多肽合成試驗，以評估總蛋白合成。結果經ISRIB處理的WFS1缺陷胰島中減少的總蛋白合成顯著恢復(圖5D，E)。此外，我們發現，與對照相比，經ISRIB處理的WFS1−/−胰島中INSGFP NKX6.1-mCherry雙陽性胰島β細胞的比例顯著增加(圖5F，G)。接下來用100 nM ISRIB或對照治療WFS1缺陷胰島2天(圖5H)。與對照物相比，經ISRIB處理的胰島中G3BP1的平均強度顯著降低，表明應激顆粒的形成減少(圖5I，J)。與此同時，經ISRIB處理的WFS1缺陷胰島中總蛋白合成也得到恢復(圖5K，L)。同時經ISRIB處理的胰島β細胞凋亡顯著減少(圖5M）。這些結果表明，抑制ISR能逆轉胰腺β細胞損失。

6. ISR抑制劑改善WFS1胰腺條件敲除小鼠的葡萄糖穩態

為了驗證ISRIB在體內的有效性，我們將WFS1-flox小鼠與Pdx1-Cre小鼠雜交，產生胰腺WFS1條敲小鼠，腹腔注射給藥2.5 mg/kg ISRIB或對照物(圖6A)。我們觀察到，在8周齡時，與對照組相比，接受ISRIB治療的WFS1缺陷小鼠的空腹血糖水平顯著降低(圖6B)。對小鼠胰腺進行了胰島素免疫染色。我們發現，與對照組相比，ISRIB處理的CKO小鼠胰腺β細胞的胰島素強度和胰島素含量顯著恢復，與WT小鼠相似(圖6C-E)。OPP標記顯示，ISRIB治療顯著恢復了CKO小鼠受損的總蛋白合成，并減少了應激顆粒的形成(圖6F-H)。此外，腹腔內糖耐量試驗顯示，與給藥小鼠相比，ISRIB治療顯著改善了CKO小鼠的糖耐量(圖6I，J)。同時，我們在體內用GSIS檢測胰島素分泌，與對照組相比，經ISRIB處理的CKO小鼠在高糖刺激下胰島素分泌明顯改善(圖6K)。值得注意的是，WT和ISRIB處理的CKO小鼠在高糖刺激下的胰島素分泌沒有顯著差異(圖6K)。這些結果表明，ISRIB可以逆轉β細胞衰竭，改善體內葡萄糖穩態?？偟膩碚f，ISRIB可用于治療WS糖尿病的胰腺β細胞衰竭和功能(圖6L)。

Wolfram綜合征是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，許多患者過早死亡。然而，由于缺乏合適的人類模型，Wolfram綜合癥的致病機制尚不明確，導致目前尚無治療方法可延緩、停止或逆轉Wolfram綜合征的發展，因此迫切需要新的Wolfram綜合癥模型進行深度探索。研究人員利用Wolfram綜合癥體外和體內模型，揭示了ISRIB在緩解胰島β細胞功能衰竭中所發揮的作用，為Wolfram綜合癥的治療提供了新思路。利用單細胞轉錄組測序技術研究了致病基因WFS1對胰島β細胞的影響，并發現ISR抑制劑ISRIB能緩解WFS1缺失的胰島β細胞的功能衰竭，且在WFS1條件性敲除小鼠中也能發揮作用。此研究為治療WS糖尿病提供了新的藥物選項。華大智造DNBelab C系列單細胞建庫平臺為該研究提供了單細胞測序支持。