質粒提取經常因操作不當引起提取的質粒不純，或遇到各種問題，
本文歸納了幾個質粒提取過程中常見的問題及解決方法供大家參考。

Q1：涂布棒在酒精蘸一下，然后燒一下，能不能保證把所用的菌燒死?

小科回答：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即時殺菌。蘸了酒精后再燒一小會，燒的是酒精而不是涂布棒。建議涂布棒干燒較長時間后，冷卻后再涂。同時作多個轉化時，應用幾個涂布棒免得交叉污染。

Q2：原先測序鑒定沒有問題的細菌，37℃搖菌后發現質粒大小或序列出現異常?

小科回答：這種情況出現的幾率較小，常出現在較大質?；虮容^特殊的序列中。解決辦法：

(1)降低培養溫度，在20～25℃下培養，或室溫培養可明顯減少發生概率；

(2)使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重組酶，如rec類等，使得質粒復制更加穩定；

(3)質粒抽提有一個酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH濃度過高造成的。

Q3：未提出質粒或質粒得率較低，如何解決?

小科回答：

(1)大腸桿菌老化：涂布平板培養后，重新挑選新菌落進行液體培養；

(2)質?？截悢档停河捎谑褂玫涂截悢递d體引起的質粒dna提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體；

(3)菌體中無質粒：有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確；

(4)堿裂解不充分：使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對低拷貝數質粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量；

(5)溶液使用不當：溶液2和3在溫度較低時可能出現渾濁，應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用；

(6)吸附柱過載：不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質粒是非常高的拷貝數或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養液體積；

(7)質粒未全部溶解(尤其質粒較大時) ：洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間；

(8)乙醇殘留：漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液；

(9)洗脫液加入位置不正確：洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率；

(10)洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致 洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率；

(11)洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積；

(12)洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1min可達到較好的效果；

Q4、細菌離心加入溶液I蝸旋振蕩后，發現菌體呈絮狀不均勻或呈細砂狀?

小科回答：推薦聯科生物快速質粒DNA小量純化試劑盒，創新的獨特buffer N8,2分鐘內獲得無沉淀的上清液而且顏色變化指示蛋白沉淀是否完全。

造成這種現象，可能的原因及解決方法：

(1)很可能是細菌發生溶菌，可減少培養時間或者試試平板培養，質粒提取前用PBS將菌落洗下，相較來說固體培養基上細菌生長的要好一些；

(2)質粒抽提過程很大程度上是受細菌生長情況決定，剛活化的菌比-80℃保存菌種所培養出來的菌液狀態好，保存久的菌株可能會造成質粒濃度低，質粒丟失等不明原因；

(3)判斷生長的菌液是否正常，可以用肉眼觀察，在光線明亮處搖蕩新鮮培養液，如果發現菌液呈漂絮狀，情況很好。如果發現呈泥水狀，即看不到絮狀，只是感覺很渾濁，則可能提不出好的質粒，或者沒有質粒；

(4)菌液不宜生長太濃，搖床速度不宜過高，達到OD600 1.5就可。

聯科生物快速質粒 DNA 小量純化試劑盒

? 核酸純化柱無須平衡液處理；

? 8分鐘內即可完成質粒DNA的制備。

抽提不同質粒及其酶切，酶切條帶干凈，無其它非特異條帶。

圖注： 1：pET28a 2：pET28a的EcoR I單酶切 3：pET30a 4：pET30a的EcoR I單酶切 5：pGEX4T1 6：pGEX4T1的EcoR I單酶切

以上文章來源生物幫。