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肝囊腺瘤是一種罕見(jiàn)疾病，占所有囊性病變的約5%，具有較高的惡性轉(zhuǎn)化傾向。術(shù)前診斷囊腺瘤較為困難，一些囊腺瘤在初診時(shí)容易被誤認(rèn)為肝囊腫。肝囊腫是一種相對(duì)常見(jiàn)的肝臟疾病，大多數(shù)為良性，但較大的肝囊腫可能導(dǎo)致膽管受壓，從而引起肝功能異常。近年來(lái)，對(duì)囊腺瘤和肝囊腫的研究越來(lái)越多，但大多仍停留在傳統(tǒng)的病例分析或臨床報(bào)告中，缺乏對(duì)囊腺瘤、肝囊腫的高通量研究。

為了深入剖析囊腺瘤與肝囊腫的差異，本研究通過(guò)對(duì)囊腺瘤和肝臟囊腫樣本進(jìn)行單核RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，旨在揭露肝囊腫和囊腺瘤的微環(huán)境差異和分子特征，為囊腺瘤的診斷提供新的視角。

1. 通過(guò)構(gòu)建囊腺瘤、肝囊腫的圖譜，揭示兩者在細(xì)胞組成上的差異

本研究通過(guò)單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探索了肝囊腫和囊腺瘤的細(xì)胞組成差異，以此來(lái)分析兩者的腫瘤微環(huán)境。基于tSNE (t-distributed stochastic neighbor embedding)分析的結(jié)果，通過(guò)降維聚類(lèi)核已知的細(xì)胞標(biāo)志物，研究從中發(fā)現(xiàn)了7類(lèi)細(xì)胞。肝囊腫和囊腺瘤的樣本中均包含了這7類(lèi)細(xì)胞。從數(shù)據(jù)中還可發(fā)現(xiàn)：（1）肝囊腫細(xì)胞中高表達(dá)PRKG1，LAMA2，CACNA1C（2）肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)CUX2，PCSK和FGL1（3）膽管上皮細(xì)胞高表達(dá)PKHD1，RALYL和DCDC2（4）內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)ST6GALNAC3，F(xiàn)LT1和PTPRB（5）T細(xì)胞高表達(dá)SKAP1，PARP8和PTPRC（6）庫(kù)普弗細(xì)胞表達(dá)SLC1A3，TBXAS1和AOAH（7）祖細(xì)胞特異性表達(dá)NRXN1，XKR4和GRIK2。

雖然肝囊腫和囊腺瘤的樣本都有這7類(lèi)細(xì)胞，但是細(xì)胞類(lèi)型的占比上卻有顯著性差異。肝囊腫組織中有更多的膽管細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞，囊腺瘤組織中則有更多內(nèi)皮細(xì)胞，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，庫(kù)普弗細(xì)胞，T細(xì)胞和祖細(xì)胞。囊腺瘤中更多的T細(xì)胞說(shuō)明了其相比肝囊腫，有著更強(qiáng)的免疫浸潤(rùn)。為了驗(yàn)證單細(xì)胞核測(cè)序的結(jié)果，研究還使用了空間轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，最后也得到了相似的結(jié)論。這說(shuō)明了肝囊腫和囊腺瘤。

2. 囊腺瘤中的肝星狀細(xì)胞比肝囊腫中的更為惡性

肝星狀細(xì)胞（HSC）是纖維化的肝中的主要細(xì)胞類(lèi)型。在肝臟受到損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞會(huì)進(jìn)入激活狀態(tài)，進(jìn)而成為生成肝損傷時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源。這也讓它成為肝病理學(xué)的的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，囊腺瘤和肝囊腫的組織中都有大量的肝星狀細(xì)胞。進(jìn)一步對(duì)這些肝星狀細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)分析，可以從中發(fā)現(xiàn)10個(gè)簇。而這10個(gè)簇在兩種病中的分布卻有明顯區(qū)別。在肝囊腫中，可以發(fā)現(xiàn)含PKHD1變異的簇，也有高表達(dá)PRG4和PDK4的簇。PKHD1變異已被確認(rèn)會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重多囊肝。PRG4則被發(fā)現(xiàn)和肝細(xì)胞癌患者預(yù)后有關(guān)，并會(huì)抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。PDK4調(diào)節(jié)的糖酵解可以從鐵死亡中保護(hù)肝星狀細(xì)胞。在囊腺瘤中，F(xiàn)OSB顯著高表達(dá)。FOSB是肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后的重要標(biāo)志物。

為了分析肝星狀細(xì)胞在兩種疾病中功能上的差異，他們又根據(jù)標(biāo)志物分別對(duì)兩種疾病樣本中肝星狀細(xì)胞的基因進(jìn)行了功能富集。結(jié)果顯示，在兩種疾病中，都富集到了和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，復(fù)合結(jié)合相關(guān)基因。在肝囊腫組織中，還特異性地富集到了和細(xì)胞貼壁和抑制酶活相關(guān)的功能的基因。而細(xì)胞貼壁在癌癥進(jìn)程中有著關(guān)鍵作用，它會(huì)促發(fā)包括免疫逃逸和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的癌癥性狀。在囊腺瘤組織中，則富集到了蛋白結(jié)合和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)被認(rèn)為在癌癥的發(fā)展和癌癥治療中的抗藥性中起到作用。

實(shí)驗(yàn)還分析了兩種疾病中的肝星狀細(xì)胞的單細(xì)胞拷貝數(shù)變異（CNV）。由此發(fā)現(xiàn)兩種疾病組織中的肝星狀細(xì)胞在染色體2，3，4，10上存在顯著的拷貝數(shù)變異，而且囊腺瘤組織中的拷貝數(shù)變異要顯著高于肝囊腫組織中的。這說(shuō)明囊腺瘤中的肝星狀細(xì)胞比肝囊腫中的更為惡性。

3. 細(xì)胞軌跡分析揭示了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在囊腺瘤和肝囊腫中的動(dòng)態(tài)變化

肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞是肝組織中的占接近80%體積的實(shí)質(zhì)細(xì)胞亞簇。根據(jù)t-SNE算法，可以分出8類(lèi)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞簇，而其中的簇3，4主要存在于肝囊腫組織中，簇1主要在囊腺瘤組織中。通過(guò)對(duì)基因表達(dá)模式的分析，可以發(fā)現(xiàn)簇3，4有著相似的表達(dá)模式。

另外，研究也通過(guò)Monocle2，對(duì)兩類(lèi)疾病中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞軌跡分析，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了兩種疾病中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化模式上的區(qū)別。肝囊腫中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞有7種狀態(tài)，包括了3種初始分支，和4種其它分支。其中，亞簇4，5主要在出現(xiàn)在分化的初期，而亞簇2，3則是在分化的末期。囊腺瘤種的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞則有5種狀態(tài)，包括了2種初始分支，和3種其它分支。其中，亞簇0主要在出現(xiàn)在分化的初期，而亞簇1，6，7則是在分化的末期。除此之外，研究者也對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了混合分析。由此可以得到5種狀態(tài)的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，包括2個(gè)初始分支和3個(gè)其它分支。其中，來(lái)自肝囊腫的亞簇2，主要存在于分化的初期，而來(lái)自囊腺瘤的亞簇6，7則租戶要存在于分化末期。與此同時(shí)，在分化不同階段，表達(dá)量存在顯著差異的基因，隨著分化增多或是減少的基因也被一同分析得出。結(jié)合已有文章中對(duì)這些基因功能的研究，可以發(fā)現(xiàn)肝囊腫中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，存在向囊腺瘤中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞演化的趨勢(shì)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在這兩種疾病中的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程。

4. T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析揭示了囊腺瘤和肝囊腫中不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制

T細(xì)胞是腫瘤免疫治療中的重要元素，其在細(xì)胞組成上的高度異質(zhì)，表達(dá)模式和功能特征會(huì)顯著影響免疫治療的效果。在囊腺瘤和肝囊腫這兩類(lèi)組織中，研究鑒定出了2047個(gè)T細(xì)胞。通過(guò)t-SNE，可以將這些T細(xì)胞分成5個(gè)簇。兩類(lèi)疾病組織中，都可以發(fā)現(xiàn)這5類(lèi)T細(xì)胞，但是比例卻明顯不同。例如0亞簇的T細(xì)胞在肝囊腫中的比例顯著高于囊腺瘤中的，1亞簇的情況則相反。通過(guò)差異表達(dá)分析可以發(fā)現(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)不同簇中表達(dá)模式上的差異。功能富集的結(jié)果也表明不同簇存在高度的功能異質(zhì)性。亞簇0的T細(xì)胞主要和新陳代謝有關(guān)，細(xì)胞處于激增和激活的狀態(tài)。亞簇2主要和T細(xì)胞受體（TCR）信號(hào)通路有關(guān)。亞簇4則和FcγR調(diào)控的吞噬作用有關(guān)。這表明，囊腺瘤和肝囊腫中部分T細(xì)胞的免疫功能，可能通過(guò)FcγR調(diào)控的吞噬作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。

另外，研究使用SCENIC分別鑒定了囊腺瘤和肝囊腫中每個(gè)T細(xì)胞簇的特異性調(diào)節(jié)因子。結(jié)果顯示，兩種疾病中T細(xì)胞簇特異性調(diào)節(jié)因子存在差異。因此，通過(guò)進(jìn)一步構(gòu)建肝囊腫和囊腺瘤的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入探討了囊腺瘤和肝囊腫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)囊腺瘤和肝囊腫中不僅存在常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因，而且存在兩種疾病的特異性轉(zhuǎn)錄因子和特異性靶基因。其中，調(diào)節(jié)靶基因數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子是FLI1，它廣泛調(diào)節(jié)囊腺瘤和肝囊腫中的多個(gè)靶基因。已有研究表明，F(xiàn)LI1可以通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子和細(xì)胞因子來(lái)影響免疫細(xì)胞的功能，也參與免疫細(xì)胞的發(fā)育、增殖、激活和遷移。此外，IKZF1僅在囊腺瘤中被發(fā)現(xiàn)，并且功能增強(qiáng)的IKZF1變體已被證明會(huì)導(dǎo)致與人類(lèi)異常T細(xì)胞分化后期相關(guān)的免疫失調(diào)。在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的一組囊腺瘤患者（n=3）中，通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）的方法，進(jìn)一步證實(shí)了IKZF1蛋白在囊腺瘤組織中的表達(dá)，而肝囊腫中則沒(méi)有。此外，我們還鑒定了一些在囊腺瘤中特異性調(diào)控的靶基因，包括CHST11、ELMO1、DOCK8和LCP2等。IHC結(jié)果也顯示，這些基因在囊腺癌中有陽(yáng)性信號(hào)，但在肝囊腫組織中沒(méi)有陽(yáng)性信號(hào)。相反，RUNX1僅在囊腺瘤中發(fā)現(xiàn)。RUNX1可以直接或間接調(diào)節(jié)癌癥增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移，增加癌癥細(xì)胞干度和抗癌藥物耐藥性。同樣，IHC結(jié)果也證實(shí)了RUNX1在肝囊腫組織（n=3）中的特異性表達(dá)。上述結(jié)果表明，T細(xì)胞在囊腺瘤和肝囊腫中具有不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，且囊腺瘤具有比肝囊腫更復(fù)雜的免疫微環(huán)境。

5. 囊腺瘤和肝囊腫中膽管細(xì)胞的差異性

膽管細(xì)胞是膽管的上皮細(xì)胞，呈柱狀，在肝門(mén)附近的大膽管和肝外膽管中分泌HCO3，通過(guò)運(yùn)輸膽汁酸來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞的存活。研究者借由t-SNE法鑒定了7個(gè)膽管細(xì)胞亞簇。囊腺瘤和肝囊腫均包含所有7個(gè)亞簇，但同樣的，不同亞簇的占比并不相同。同時(shí)，研究也分析了一系列的特征基因在每個(gè)膽管細(xì)胞簇中的表達(dá)情況。其中，亞簇1、2、5和6均高表達(dá)Adnexin A4（ANXA4）基因。研究表明，Anxa4在癌癥的診斷、預(yù)后和治療中起著重要作用。簇5特異性高表達(dá)TMC5，據(jù)報(bào)道，TMC5也是與肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因。簇6高表達(dá)PSTPIP2。文獻(xiàn)證實(shí)，PSTPIP2的甲基化通過(guò)調(diào)節(jié)STAT1和NF-κB途徑增強(qiáng)酒精誘導(dǎo)的肝損傷中的炎癥。

隨后，研究又對(duì)肝囊腫和囊腺瘤中差異表達(dá)的膽管細(xì)胞標(biāo)記基因進(jìn)行了功能富集。膽管細(xì)胞的標(biāo)志物在肝囊腫中特異性富集到了與ERK1和ERK2相關(guān)的功能的基因。ERK1和ERK2是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與Ras-Raf MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)。該級(jí)聯(lián)參與調(diào)節(jié)多種過(guò)程，包括細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期、遷移、存活、分化、代謝、增殖和轉(zhuǎn)錄。另外，在囊腺瘤中，則富集到了磷脂酰肌醇3−激酶的正調(diào)控相關(guān)基因。磷脂酰肌醇3-激酶是進(jìn)化過(guò)程中生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵因素，也在許多生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫。有報(bào)道指出，肝囊腫中，存在膽管細(xì)胞起源的情況。這表明，膽管細(xì)胞可能通過(guò)ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活Ras-Raf MEK-ERK信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和細(xì)胞增殖等過(guò)程，導(dǎo)致肝囊腫的形成和發(fā)展。在囊腺瘤中，膽管細(xì)胞通過(guò)PI3K信號(hào)通路參與囊腺瘤的進(jìn)展，PI3K可能是囊腺瘤的標(biāo)志，PI3K信號(hào)通路的靶向治療可能抑制囊腺瘤的生長(zhǎng)。

6. 囊腺瘤的內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力高于肝囊腫的

內(nèi)皮細(xì)胞是人體內(nèi)的單層鱗狀上皮細(xì)胞，主要位于血管內(nèi)壁。研究通過(guò)t-SNE對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的進(jìn)一步亞簇分析顯示，內(nèi)皮細(xì)胞被分為五個(gè)亞簇。同樣，肝囊腫和囊腺瘤都含有來(lái)自所有五個(gè)亞簇的細(xì)胞，但比例不同。同時(shí)，也對(duì)每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞亞群中特征基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，簇0特異性表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的外排泵基因ABCB1。簇1特異性高表達(dá)可增加肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)率的RELN。簇2高度表達(dá)與肝硬化高凝狀態(tài)相關(guān)的VWF基因。在差異表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的功能富集中，研究發(fā)現(xiàn)MAPK級(jí)聯(lián)相關(guān)功能基因在囊腺瘤中得到特異性富集。而MAPK級(jí)聯(lián)的異常調(diào)節(jié)可以影響在腫瘤發(fā)生中起重要作用的關(guān)鍵信號(hào)元件。同時(shí)，也特異性富集到與細(xì)胞粘附的正調(diào)控相關(guān)途徑的基因。細(xì)胞粘附介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的滲透屏障，將血流與下方器官和組織分離，并控制液體、溶質(zhì)和細(xì)胞沿血管壁的輸運(yùn)。這表明囊腺瘤中的內(nèi)皮細(xì)胞比肝囊腫具有更高的遷移能力和更高的惡性風(fēng)險(xiǎn)。

原文鏈接

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0010482524006255