文章標題：Roseburia hominis Increases Intestinal Melatonin Level by?Activating p-CREB-AANAT Pathway

發表期刊：Nutrients

影響因子：6.706

作者單位：北京大學第三醫院

百趣生物提供服務：非靶標代謝組學

一．研究背景

褪黑素可以維持晝夜節律并調節免疫功能，也分布在胃腸道，在局部發揮重要的抗氧化和抗炎功能，并調節腸道運動。然而，口服褪黑素會引起一些不良反應，因此希望找到一種局部誘導褪黑素合成的方法，以避免當其用于消化系統疾病治療時的不良影響或激素紊亂的風險。作者以前的研究結果表明，Roseburia hominis的豐度與結腸粘膜褪黑素的表達呈正相關，然而是否調節腸道褪黑素表達及其潛在機制尚不清楚。在本研究中，利用無菌大鼠和EC模型BON-1來確定Roseburia hominis與褪黑素之間的關系，以及涉及丙酸鹽、丁酸鹽、5-HT和磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（p-CREB）-AANAT途徑的具體機制。研究這些方面可能為IBS或炎癥性腸病提供新的治療策略。-百趣代謝組學解讀

二．材料和方法

動物實驗

實驗一：使用R. hominis或磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）分別喂食大鼠，并在14天后使用腹部回撤反射評分評估其內臟對直腸擴張的敏感性，之后收集其腸n內容物用于短鏈脂肪酸分析，血清用于褪黑素測定。

實驗二：給大鼠喂食丙酸鈉、丁酸鈉或相同體積的PBS，七天后收集腸組織用于IHC，Western。印跡、ELISA和qPCR，收集血清進行褪黑素測定。

細胞實驗

使用和未使用色氨酸羥化酶抑制劑預處理的BON-1細胞，用細菌培養基，R. hominis上清液，PBS，丙酸鈉或丁酸鈉處理后提取總蛋白和上清液進行進一步分析。

實驗結果（1）R. hominis增加了大鼠腸和BON-1細胞中的褪黑素水平

百趣生物解讀，與對照組相比，口服R.hominis的大鼠，回腸和結腸粘膜中褪黑素陽性細胞的數量顯著增加（p<0.05，圖1B）。當用20%和50%比例的R.hominis上清液處理BON-1細胞24小時后，與對照組相比，細胞上清液中的褪黑素濃度顯著升高（p<0.05，圖1C）。此外，使用靶向代謝組學檢測到，R. hominis的施用還增加了盲腸和結腸內容物中丙酸鹽和丁酸鹽的濃度（p<0.05，圖1D）。

圖1

（2）丙酸鹽和丁酸鹽增加了大鼠腸道和BON-1細胞中的褪黑素水平

與對照組相比，口服丙酸鈉或丁酸鈉的大鼠，回腸和結腸粘膜中褪黑素陽性細胞的密度顯著增加（p<0.05，圖2B）。當用丙酸鈉或丁酸鈉處理BON-1細胞24小時后，與對照組相比，上清液中的褪黑素濃度增加（p<0.05，圖2C）。

圖2

（3）丙酸鹽和丁酸鹽通過促進5-HT的產生增加褪黑素水平

百趣代謝組學解讀，在丙酸鹽或丁酸鹽處理后測量5-HT水平?？诜徕c或丁酸鈉的大鼠，回腸和結腸粘膜中5-HT陽性細胞的數量增加（p<0.05，圖3A,3B）。當用丙酸鈉或丁酸鈉處理BON-1細胞24小時后，與對照組相比，細胞裂解液中的5-HT濃度顯著升高（p<0.05，圖3C）。替洛司他是色氨酸羥化酶（TPH）的抑制劑，TPH是5-HT生物合成的限速酶，用替洛司他乙酯（1μM）預處理2小時可防止丙酸鹽或丁酸鹽給藥引起的5-HT水平升高（圖3C）。乙基替洛司他治療也抑制了褪黑素水平的增加（圖3D）。

圖3

（4）丙酸鹽和丁酸鹽通過p-CREB-AANAT途徑增加褪黑素水平

百趣解讀，口服丙酸鈉或丁酸鈉的大鼠，可顯著增加腸道組織中的AANAT水平（p<0.05，圖4A）。一致地，當用丙酸鈉或丁酸鈉處理BON-1細胞24小時后，AANAT水平顯著增加（p<0.05，圖4B、C）。用Aanat的小干擾RNA（siRNA）預處理降低了BON-1細胞中的Aanat和褪黑素水平（p<0.05，圖4B、C）。此外，在體內和體外，丙酸鹽和丁酸鹽處理后，Aanat mRNA水平顯著升高（p<0.05，圖4D、E）。

圖4

（5）丙酸鹽和丁酸鹽調節代謝產物和相關代謝途徑

百趣代謝組學解讀，PCA得分圖表明，與對照組相比，丁酸鹽處理顯著影響代謝譜[R2X（cum）=0.693]，而丙酸鹽組沒有有效地與對照組[R2X（cum）=0.73]分離（圖5A）。采用比主成分分析具有更好鑒別能力的OPLS-DA來基于類別信息表征代謝譜。OPLS-DA評分圖顯示了丙酸鹽組和對照組之間的明顯聚類[R2X（cum）=0.512，R2Y（cum）＝0.951，Q2（cum=0.252]，以及丁酸鹽組和控制組之間的聚類[R2X（cum）+0.477，R2Y（cum）-0.944，Q2（cum）=0.628]（圖5B）。

根據OPLS-DA模型的卡值（VIP）>1和p<0.05篩選差異代謝物。丙酸鹽組有43種，其中的31種上調，包括次黃嘌呤、丙酮酸、D-丙氨酸和吲哚。丁酸鹽組有40種，其中有10中上調，如丙酮酸、次黃嘌呤和肌苷。然后，基于BON-1細胞上清液中的差異代謝物進行路徑富集和拓撲分析。與對照組相比，丙酸鹽組豐富了以下途徑，包括氨基酸代謝途徑，如“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成”、“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”和“色氨酸代謝”；碳水化合物代謝途徑，如“檸檬酸循環”、“丙酮酸代謝”和“丁酸代謝”；核苷酸代謝途徑，如“嘌呤代謝”；以及其他氨基酸的代謝，如“牛磺酸和低?；撬岽x”（圖5C）。丁酸鹽組富含以下途徑：氨基酸代謝途徑，如“甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝”和“纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成”；碳水化合物代謝途徑，如“丁酸代謝”和“丙酮酸代謝”；以及其他氨基酸的代謝，如“?；撬岷偷团；撬岽x”（圖6C）。

分析了代謝產物水平與BON-1細胞上清液中褪黑素、AANAT、p-CREB和5-HT水平之間的關系。相關分析表明，各種代謝物的水平與褪黑素、AANAT、p-CREB和5-HT的水平顯著相關。具體而言，丙酮酸與褪黑素、AANAT、p-CREB和5-HT呈正相關；肌苷與褪黑素、AANAT和p-CREB呈正相關；次黃嘌呤和乙酰膽堿與褪黑素和AANAT正相關；吲哚與褪黑素呈正相關，表明這些代謝物可能促進褪黑素合成（圖5D）。

圖5

討論

百趣代謝組學解讀，腸道褪黑素對胃腸道有多種作用。除了可能有效改善睡眠問題和一些精神癥狀之外，當用于IBS治療時，褪黑素的抗炎等作用顯示出改善腹痛和患者生活質量的能力。然而，長期外源性褪黑素治療可能會引起頭痛、皮疹和噩夢等不良反應。此外，以前的研究很少關注腸源性褪黑素對消化系統疾病的影響。

R.hominis是羅氏菌屬的代表種，羅氏菌屬豐度的改變可能影響多種代謝途徑，并與多種疾病相關，包括IBS、潰瘍性結腸炎、肥胖、2型糖尿病、神經系統疾病和過敏。富含可發酵碳水化合物的飲食增加了羅氏菌屬的相對豐度，羅氏菌屬能夠降解多糖、低聚糖和糖，表明可發酵碳水化合物可能通過增加羅氏菌屬的豐度來提高腸道褪黑素。

本研究中表明丙酸鹽與丁酸鹽可能都在促進褪黑素合成方面發揮類似作用。此外雖然相關研究較少，但二者具有一些獨特的健康促進特性，如降低脂肪生成和血清膽固醇水平以及抗癌作用。

本研究表明丙酸鹽與丁酸鹽通過提高5-HT水平來調節褪黑素合成。其中丙酸鹽可能通過激活色氨酸代謝增加褪黑素合成，這需要進一步驗證。先前的一項研究發現，補充?；撬犸@著提高了海馬中的p-CREB水平，改善了大鼠的抑郁行為，表明丙酸鹽和丁酸鹽可能激活p-CREB-AANAT信號，并通過增強?；撬岽x促進褪黑素合成。此外，丁酸處理顯著增加了BON-1細胞上清液中的肌苷水平。動物實驗表明，肌苷注射顯著增加大鼠海馬和前額葉皮質的p-CREB水平。相關性分析顯示肌苷水平與褪黑素、AANAT和p-CREB水平之間存在正相關，表明肌苷可能通過增加p-CRAB和AANAT水平促進褪黑素合成，這需要進一步研究（圖6：R.hominis在腸道褪黑素合成中的潛在機制）。

圖6

三．結論

總之，R.hominis通過其代謝產物丙酸鹽和丁酸鹽增加了腸道褪黑素的合成。潛在機制是丙酸鹽和丁酸鹽促進5-HT合成并激活p-CREB-AANAT途徑。我們的研究提供了新的證據，證明微生物群干預可以通過增加腸道褪黑素水平，成為某些腸道疾?。ㄈ鏘BS和炎癥性腸?。┑臐撛谥委煵呗?。

文/阿趣代謝組學