Advanced Science | 鄭宏庭教授團隊揭示GCGR激活下的肝臟脂肪代謝調控新機制

英文標題：CD9 Counteracts Liver Steatosis and Mediates GCGR Agonist Hepatic E?ects

發表期刊：Advanced Science

影響因子：14.3

客戶單位：中國人民解放軍陸軍軍醫大學第二附屬醫院

百趣提供服務：靶標代謝流

代謝功能障礙相關脂肪性肝病(Metabolic Dysfunction Associated Steatotic Liver Disease, MASLD)的特征是肝細胞內脂質過度積聚，已成為慢性肝病和肝細胞癌的主要原因。胰高血糖素受體(Glucagon receptor, GCGR)激動劑是治療肝臟脂肪變性的一種有前途的治療選擇，而GCGR激活在治療MASLD中的潛在機制仍不清楚。本文發現四跨膜蛋白CD9可能介導GCGR激動劑的肝臟作用。CD9在MASLD患者的脂肪肝中表達減少，并在GCGR激活時上調。肝臟中CD9的缺乏通過調控補體因子D(Complement Factor D, CFD)介導的脂肪酸代謝，加劇飲食誘導的肝脂肪變性。因此，CD9可以調節GCGR信號對肝臟的有益作用，并可能成為治療肝臟脂肪變性的有希望的靶點。

1.CD9在患者和小鼠的脂肪肝中下調，并在GCGR激活后上調

為了篩選可能與GCGR激動劑對肝臟的影響相關的基因，作者分析了兩個公開的基因表達數據集。一個是注射了高選擇性GCGR激動劑的小鼠肝臟(GSE135881)，據報道該激動劑可改善肝臟脂肪變性。另一個是高脂肪飲食(High-Fat Diet, HFD)誘導的脂肪肝(GSE94754)，12個基因在GCGR激動劑治療和疾病模型之間表現出相反的表達變化，在GLP-1/GCGR激動劑(Cot)激活GCGR信號后，肝臟中的CD9和NOX4表達發生了變化，并且CD9的改變比NOX4更明顯。隨后研究了CD9參與GCGR信號對肝臟的影響的可能性。在MASLD患者的肝臟中觀察到mRNA和蛋白質水平的CD9顯著降低（圖1B）。與相應的對照相比，小鼠模型（HFD、ob/ob和db/db）的肝臟中CD9表達持續下調（圖1C）。此外，在體內和體外，Cot激活GCGR信號后，肝臟中CD9表達均上調。

2.肝臟中CD9缺失通過調節脂肪酸代謝加劇HFD下的肝臟脂肪變性

作者用含有肝細胞標志物甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子的重組腺相關病毒8載體(AAV8)敲低肝臟CD9（即AAV-shCD9）。AAV-shCD9治療導致小鼠肝臟中CD9特異性缺失，但不會在骨骼肌、脂肪組織、大腦或腎臟中缺失。觀察到AAV-shCD9小鼠和正常飲食(normal chow diet，NCD)下的AAV-shCtr小鼠的肝臟脂肪變性之間沒有顯著差異，與HFD處理下的AAV-shCtr小鼠相比，AAV-shCD9小鼠的肝臟脂肪變性更為嚴重，體重、肝重和肝重/體重增加。還檢測到高表達的肝臟甘油三酯(TG)，組織學和油紅O染色進一步證實了AAV-shCD9小鼠肝細胞中脂質積累明顯加劇(圖2C)。

此外，RNA測序(RNA-seq)和進一步的qPCR分析均表明，CD9缺乏主要增加脂肪酸合成基因，而不是與脂肪酸吸收和運輸相關的基因。脂肪酸合成基因增加和脂肪酸氧化基因減少進一步通過其在敲低CD9小鼠肝臟中的蛋白質表達得到驗證。根據體內實驗結果，轉染CD9小干擾RNA(siRNA)后，肝細胞內TG含量和脂質積累增加，而在游離脂肪酸處理下CD9過表達則減弱(圖2E、F)。此外，¹³C同位素測定評估體外脂肪生成和脂肪酸氧化進一步證實了CD9對脂肪生成和脂肪分解的調節(圖2G）?？傊?，這些發現表明CD9缺乏通過增強脂肪酸合成和抑制HFD下的氧化來加速肝臟脂肪變性。

3.CD9通過FLI1泛素化調控CFD通路來調節肝臟脂肪酸代謝

研究通過分析CD9基因缺失時肝臟中差異表達的基因，探討了CD9對肝臟的影響。排名第一的基因CFD的mRNA表達發生了顯著變化。進一步分析發現，CD9和CFD在MASLD進展過程中呈負相關。CFD的敲除抑制了CD9缺失誘導的肝臟脂肪變性，而CFD的過表達導致了與CD9缺失相似的效果。這些發現表明，CD9缺失主要通過CFD誘導加速肝臟脂肪變性（圖3）。

4.CD9通過CFD調節脂肪組織的脂肪生成和燃燒來影響體重

在肝臟中敲低CD9會導致體重變化，脂肪組織的重量增加，脂肪細胞體積增大。間接熱量測定法研究顯示，CD9影響能量消耗，但不影響食物攝入或體力活動。在CD9基因缺陷小鼠的脂肪組織中觀察到產熱基因減少和脂肪生成基因增加。CD9缺陷小鼠的血清誘導脂肪細胞中的脂肪生成基因，這可能是通過循環因子CFD實現的。CD9缺陷小鼠體內的CFD水平升高，其受體C5aR在調節脂肪細胞功能方面發揮了作用（圖5）。

5.過表達肝臟中的CD9可減輕肝臟脂肪變性

接下來，作者評估了在HFD小鼠中挽救肝臟CD9表達的效果（圖6A）。AAV8-TBG-CD9過表達肝臟CD9顯著降低了體重、肝重和肝重/體重（圖6B），并改善了肝臟TG、脂質積累以及相關的脂質基因和蛋白質表達（圖6C-E）。丙氨酸氨基轉移酶的肝酶活性顯著降低，表明AAV-CD9也改善了肝功能（圖6F）。此外，CD9強化降低了CFD并增加了FLI1蛋白水平（圖6G），這與前面提到的機制觀察結果一致。這些發現表明CD9過表達可減輕MASLD的發展。

6.CD9促進GCGR激活對肝臟的益處

為了確定CD9是否參與了GCGR激動劑對肝臟的影響（圖7A）。作者使用了GCGR/GLP1R雙激動劑Cot，因為已經證明肝臟作用主要通過GCGR實現，而肝外改善則通過GLP1R實現。結果發現Cot緩解了肝臟脂肪變性，表現為體重、肝重和肝重/體重比、肝臟TG含量和形態的降低，以及脂肪酸合成和氧化基因和蛋白質的改變，用AAV-TBG-shCD9降低肝臟CD9可顯著消除Cot治療對脂肪變性和脂質蓄積的緩解，體重除外（圖7B-E），這些結果表明Cot對肝臟有益是通過CD9引起的GCGR信號轉導實現。而不是GLP1R引起的肝外體重改善。

本文篩選了四跨膜蛋白CD9可能調節GCGR激動劑的肝臟作用。CD9在MASLD患者的脂肪肝中減少，并在GCGR激活時上調。作者發現CD9通過泛素化-蛋白酶體降解FLI1來調節CFD表達，從而調節肝臟脂肪酸合成和氧化基因。CD9通過CFD調節脂肪組織的脂肪生成和產熱，從而影響體重，減輕肝脂肪變性。因此，CD9可以調節GCGR信號對肝臟的有益作用，并可能成為治療肝臟脂肪變性的有希望的靶點。