純化蛋白的方法很多，從最初的蛋白提取液粗樣品開始，經過一系列的粗細分離步驟，逐步提高蛋白的純化度，在不斷重復的實驗步驟中，獲得純度極高的蛋白質產品。

一般的蛋白純化分離步驟包括：

當我們獲得含有一些多糖、核酸、細胞碎片等雜質的蛋白質粗制提取液后，首先就要選用合適的方法，將我們不需要的雜蛋白和其他物質分離出去，這一步的分離不用過于精細，使用常規的等電點沉淀、鹽析和有機溶劑分級分離等方法即可。這幾種方法的特點是簡單方便，處理量大，既能濃縮蛋白溶液，又可以除去大量雜質。在工業中一些蛋白提取液體積較大，又不適用于用沉淀或鹽析法進行濃縮處理，我們便可采用凝膠過濾、超過濾、冷凍真空干燥或其他方法進行濃縮提純。

樣品經過粗分級分離之后的溶液體積會明顯變小，其中含有的雜蛋白和其他雜質多數已被除去，之后一般會使用色譜法來進行第二次的精細分離。細分級分離的方法一般規模較小，但分辨率很高。細分離方式包括離子交換色譜、吸附色譜，凝膠過濾以及親和色譜等。必要時還可選擇區帶電泳，等電點聚焦電泳等方式作為最后的純化步驟。

蛋白質分離純化的最后一步就是形成結晶，只有某種蛋白在溶液中的數量占有極大優勢時才會形成相應的蛋白結晶。重結晶可除去少量夾雜的蛋白，因此結晶的過程本身也伴隨著一定程度的純化。由于結晶的過程中從未出現過蛋白質變性的現象，因此蛋白也不會在此過程中被破壞。

圖1. 蛋白結晶圖示

使用離子交換色譜進行細分級分離是較為常見的一種蛋白純化方式。它是根據蛋白質的電荷不同來分離蛋白質混合物，被分離的目的蛋白所攜帶的電荷能與離子交換劑中所帶的相反電荷相結合，而且這兩者之間的結合作用是可逆的，通過逐漸增加離子強度或改變洗脫液PH值的方式處理色譜柱，離子交換劑上結合的目的蛋白便可與洗脫液中的離子發生交換而被洗脫到溶液當中。

由于不同蛋白質的電荷不同，其與離子交換劑的結合能力也不同，所以根據蛋白洗脫到溶液中的先后順序來進行提取，就可以輕松分離出我們需要的目標蛋白。

圖2. 離子交換色譜的過程

離子交換劑是由具有網狀結構的不溶于水的高分子聚合物構成，其骨架上含有很多共價結合的帶電基團，如果基團的側鏈帶有正電荷，就可以與溶液中的負離子結合，稱之為陰離子交換劑，可以吸附帶負電荷的蛋白質。如果基團側鏈帶有負電荷，則可以與溶液中的正離子相結合，稱為陽離子交換劑。這就如同一個帶有N端磁鐵吸附能力的篩子，將與它可以結合的，帶有S端的鐵粒子吸附在篩子上，而帶了與其相同磁性的N端鐵粒子則由于排斥作用漏出篩子，從而分離出S端鐵粒子和N端鐵粒子。

離子交換劑的介質種類還可分為離子交換樹脂、離子交換纖維素和離子交換凝膠等。強離子交換樹脂保持離子化的PH值范圍較寬，而弱離子交換樹脂若想保持離子化，就只能在很窄的PH值范圍內進行處理。離子交換色譜的優點是具有極高的分辨率，因此可以通過放大規模的方式直接應用于工業生產中。根據數據統計結果可知，大多數蛋白質的靜電荷是為負值，因此陰離子交換色譜的應用在純化蛋白領域的最為廣泛。

選擇離子交換介質時，首先要考慮的一點就是目的蛋白的分子大小，因為蛋白分子的大小不但會影響介質上的帶電基團，還會影響介質對蛋白分子的動力載量，從而影響分離的效果和速度。

聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強的離子交換劑介質一般常用于分離小分子物質，例如無機離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑介質的親水性較強，并且具有較大的表面積和松散的親水性網狀結構，所以更適合于分離蛋白質等大分子物質。

1. 纖維素離子交換劑通常適于初步分離和大量制備工業，雖然介質的價格較低，但分辨率和穩定性也相對較差。

2. 葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格都比較適中，但其介質容易受到外界環境的影響，隨離子強度和pH值變化，介質的體積也會有較大改變，從而影響蛋白的分辨率。

3. 瓊脂糖離子交換劑介質的穩定性好，分辨率也很高，但價格偏貴，分離時間也比較長，因此不常用于大規模的蛋白工業生產。

離子交換劑介質的顆粒大小也會對蛋白的分離效果有一定的影響。離子交換劑顆粒一般呈球形，顆粒的大小通常以目數(mesh)或者顆粒直徑(mm)來表示，目數越大表示直徑越小。一般來說顆粒越小，分辨率越高，但同時離子裝柱時的平衡時間會變長，流速也會減慢，而顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑更適合于對分辨率要求不高的大規模工業制備性分離，而小顆粒的離子交換劑則適用于實驗室中需要高分辨率的蛋白分析或分離。

離子交換色譜的流動相必需是具有一定離子強度并對PH有一定緩沖能力的溶液，為了防止目的蛋白失活或變性，流動相的PH值需要盡量保持一定程度的穩定性，使其在色譜過程中不會發生明顯的變化，從而穩定目的蛋白分子上的電荷量，保證色譜結果的準確性。起始緩沖液的濃度應當盡可能低（＜100mmol/L）,這樣可以使色譜柱中的介質吸附更多需要分離的物質，緩沖液中應當不含會影響被分離物質活性和溶解度的成分。

離子交換色譜通常選用粗短柱，即高徑比小的色譜柱，典型的離子交換色譜柱高度在5-20CM，高徑比一般小于5。如果需要增加離子交換劑的體積，只能增加色譜柱的直徑而不能增加其高度。如果是進行連續梯度洗脫，才可以適當增加色譜柱的長度。

圖3. 各種大小的色譜柱圖示

離子交換結束后的洗脫過程可以采用保持洗脫液成分一直不變的方式進行分段洗脫，也可以采用改變洗脫的鹽濃度或(和)pH的方式洗脫，這種方式又稱為跳躍式洗脫或漸進式梯度連續改變洗脫。梯度洗脫一般分離效果好,分辨效率高,特別是使用交換容量小，對鹽濃度敏感的離子交換劑時，但對于蛋白類產品而言，在洗脫時盡量不要采用PH梯度法進行洗脫，因為這種方法可能會對蛋白產品產生一定影響，導致蛋白結構發現變化。因此逐步增加離子強度的洗脫方法在處理蛋白產品中出現的較多一些，可以降低很多不必要因素的影響，提高純化效率。

選擇好合適的離子交換色譜材料后，通過預處理裝柱、色譜柱平衡、加樣、洗脫的全過程，就可以得到純度極高的目標蛋白產品。若一次色譜后的純度依舊不理想，還可以進行多次重復實驗，以保證目標蛋白的高純度提取。

參考文獻：

1. 佚名. 蛋白質純化技術及應用[M]. 2005.

2. 陳浩, 陳于紅, 朱德煦,等. 重組蛋白質純化技術[J]. 中國生物工程雜志, 2002, 22(5):87-92.

3. 徐其進中, 黃駿雄. 蛋白質分離與純化過程中高效離子交換色譜柱的再生[J]. 分析化學, 2000, 1(1):46-49.

4. Walton H F . Ion Exchange Chromatography[J]. Analytical Chemistry, 1968, 40(5):51R-62R.

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