取材

取材應盡可能新鮮。由于RNA降解較快，所以新鮮組織和培養細胞最好在30min內固定。

固定

固定的目的是很大限度地保持細胞內DNA或RNA水平。較常用的固定劑是多聚甲醛，多聚甲醛不會與蛋白質產生廣泛的交叉連接，因而不會影響探針穿透入細胞。

通透

1、稀酸或酸酐處理

為防止探針與組織中的堿性蛋白之間產生靜電結合，從而降低背景，雜交前的標本可用0.25%的乙酸酐處理，經乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團通過乙?；蛔钄?。組織或細胞標本亦可用0.2M HCl處理，稀酸能使堿性蛋白變性，再結合蛋白酶消化，可將堿性蛋白去除。

2、去污劑處理

去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進入組織細胞，較常用的去污劑是Triton X-100。需要注意的是，過度的去污劑處理不僅影響組織的形態結構，而且還會引起靶核酸的丟失。

3、蛋白酶處理

蛋白酶消化能使固定后被遮蔽的靶核酸暴露，從而增加探針與靶核酸的接觸，常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），鏈霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）。

雜交緩沖液孵育

雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育，可以阻斷玻片和標本中可能與探針產生非特異性結合的位點，達到減低背景的目的。

變性

進行雜交反應時，探針和靶核酸都必須是單鏈的，因此雙鏈DNA探針在雜交前必須進行變性，并且探針變性后要立即進行雜交反應，不然解鏈的探針又會重新復性。

探針的選擇

選擇探針的基本原則是有高度的特異性。根據探針的來源可分為，基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。DNA探針、RNA探針在合成時需要控制探針片段長度，通常在300-1000bp左右，DNA探針在雜交過程中可能會出現探針雙鏈之間退火，也更容易在溶液中形成大分子的探針聚合體，從而影響其滲透能力，RNA探針因其單鏈、高分子結合力、可適應高溫雜交的特性，其檢測特異性和靈敏度均優于DNA探針。寡核苷酸探針的長度較短，避免了探針內部退火的問題，雜交時的滲透能力也更好。以上每種探針都有各自的優缺點，可根據具體的實驗進行選擇。

探針的長度、濃度

探針的長度和濃度也是我們選擇探針時需要考慮的因素。

1、探針的長度

一般應在50-300個堿基之間，最長不宜超過400個堿基。探針過長，不容易進入細胞；過短，特異性不高。

2、 探針的濃度

探針的濃度依其種類和實驗要求略有不同，一般為0.5-5.0μg/mL。最適宜的探針濃度要通過預實驗才能確定。探針濃度過高會造成背景染色加深，濃度過低會導致熒光信號不足。

探針標記

這里主要介紹熒光標記染料，包括以下幾種：

1、熒光素類染料

熒光素類染料包括標準熒光素及其衍生物，如異硫*酸熒光素（FITC）、羥基熒光素（FAM）、四氯熒光素（TET）等，其中FITC是較常用的一種熒光素染料。

2、羅丹明類染料

羅丹明類染料（rhodamine dye）也是常用的蛋白質分析染料之一，主要包括R101、四乙基羅丹明（RB200）和羧基四甲基羅丹明（TAMRA）等。與熒光素類染料相比，羅丹明類具有更強的光穩定性、更高的熒光產量和更低的pH敏感性。

3、菁染料

目前應用比較廣泛的菁標記染料主要有兩類，一類是噻唑橙（thiazole orange, TO）、噁唑橙（oxazole orange, YO）系列及其二聚體染料，另一類是多甲川系列菁染料。

4、其他熒光染料

二苯乙烯、萘酰亞胺、香豆素類、吖啶類、芘類等。

直標型探針和間標型探針

直標型探針是指DNA探針直接與熒光素基團共價連接，間標型探針則是指DNA探針先與半抗原（生物素、地高辛）連接，然后半抗原再與熒光素基團連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團這種類似“三明治”的復合物。與間標型探針相比，直標型探針具有低背景、高特異性、簡單、性價比高等特點，并且隨著熒光染料和熒光檢測技術的不斷發展，直標型探針的靈敏度也在不斷提高。在FISH檢測領域，尤其是在疾病分型領域，探針大多采用直標型設計。

雜交溫度、時間

雜交溫度是雜交能否成功的一個關鍵因素。較佳的措施是使用一些FISH的專用儀器進行操作。如果是手工操作，首先需要對可能使用到的儀器進行溫控能力的檢查，如水浴鍋、孵箱（疾病診斷中的探針要求溫控精度在0.5度以內）。其次，要盡可能地保持操作環境溫度在20度以上，這對于在冬季進行的FISH操作尤為重要。此外對于需要預熱以達到要求溫度的試劑，在使用前必須使用溫度計對其進行測溫。最后，操作者往往會忽視一些小部件的溫度，諸如載玻片和蓋玻片，尤其是在冬季，蓋玻片本身的溫度就低，加之探針的量不多，如果沒有事先預熱蓋玻片就會使雜交液的溫度急劇下降，嚴重影響探針和目標DNA的雜交效率。

雜交時間對結果的影響也較大。雜交時間過短會造成雜交不完全，過長則會增加非特異性雜交。大部分的DNA探針雜交時間為2-4hr，但是為了穩妥起見，一般將反應時間定為16-20hr。雜交反應的時間應當與探針的長度和細胞通透性有關，在充分進行通透性處理之后，寡核苷酸探針只需要2-6hr便可完成雜交。

降低背景

熒光原位雜交中背景染色是由多種因素造成的，雜交后的洗滌能夠降低背景染色。預雜交也是降低背景染色的一種有效手段，預雜交液與雜交液的區別在于前者不含有探針，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態結構的破壞以及標本的脫落；硫酸葡聚糖能與水結合，減少雜交液的有效容積，從而提高探針的有效濃度，以達到提高雜交率的目的；在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，可以阻斷探針與組織結構成分之間的非特異性結合，從而減低背景。另外，強烈建議使用滅菌去離子水配制各種所需的試劑，配制后使用pH計檢測是否符合要求。每次FISH均使用新的試劑，舊的試劑最好棄置不用。洗脫液和變性液當天用當天配。最后，防止污染，由于在手指皮膚及實驗室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其影響實驗結果，在整個雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤(180℃)以達到消除RNA酶的目的。

參考文獻：

江冬瑞, 王弦, 吳強. 熒光原位雜交技術操作的常見問題分析. 臨床與實驗病理學雜志. 2015;31(12):1426-1427.

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