在前面的文章中，我們已經為大家介紹了CRISPR系統以及CRISPR/Cas9技術在基因治療中的研究進展。還沒有看過的小伙伴，戳這里
今天我們聊聊以293T細胞為例，CRISPR/Cas9基因敲除細胞的構建。
一些實驗前的說明
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sgRNA驗證：在實驗開始前，可以通過sgRNA在線驗證，篩選高效率的sgRNA用于敲除細胞系的構建。
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基因拷貝數：建議在開始實驗之前確定目標基因的拷貝數。許多永生化細胞系，尤其是癌細胞系，不是二倍體，因此可以具有3個或更多的染色體副本。
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質粒的質量：使用高質量的無內毒素質粒DNA至關重要。通過讀取260 nm處的吸光度確定DNA濃度。通過使用260 nm / 280 nm的比例（該比例應在1.8到2.0的范圍內）來測量DNA純度。通過瓊脂糖凝膠電泳檢查質粒的完整性。
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細胞狀況：使用維護良好并經過常規認證的高質量細胞，包括檢測細菌，真菌或支原體污染。如果細胞來自新復蘇的細胞，則在使用前至少完成2次傳代。
圖1. CRISPR基因敲除細胞系實驗步驟概況。
實驗步驟
sgRNA和genotype primers的設計合成
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sgRNA設計：對靶基因序列進行分析，篩選合適的靶位點，每個靶位點設計1條sgRNA。通常，將Cas9靶向編碼功能蛋白結構域外顯子的sgRNA比單純靶向5'外顯子更有可能消除基因功能。
圖2. sgRNA設計示意圖。
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PCR引物設計：根據靶位點設計PCR引物，用于后續靶位點DNA突變檢測。
載體構建
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根據設計的 sgRNA 序列，合成 Oligo DNA。酶切帶有 Cas9 基因的空載體（帶有熒光標簽（GFP）和篩選基因（嘌呤霉素））得到線性化質粒，混合 Oligo DNA與線性化空載體，以T4 連接酶連接，添加 buffer 與 ddH2O，16℃連接過夜。
質粒驗證
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將連接產物轉入DH5α大腸桿菌，37℃培養過夜。挑選單菌落進行擴增，提取質粒，進行酶切鑒定。
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對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，挑選具有正確大小的酶切產物進行測序驗證。
質粒提取與質量檢測
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將驗證的質粒轉入新的DH5a感受態大腸桿菌中，37℃培養過夜。挑取單菌落進行擴增培養，提取質粒。檢測內毒素；進行其吸光度檢測（260 nm / 280 nm的比例在1.8~2.0）；并通過瓊脂糖電泳檢測質粒的完整性。
轉染前
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轉染前1天，將生長狀態良好的293T細胞鋪在6孔板中，每個孔的細胞約1.0 x 105 -3.0 x 105個。細胞培養箱中培養過夜，至90%~95%的細胞密度。
轉染
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將轉染所需試劑在37℃水浴鍋中預熱（包括Opti-MEM、質粒）。
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按照下圖進行細胞轉染。
圖3. 細胞轉染示意圖。
單克隆篩選及鑒定
轉染24 h后，即可有少部分質粒表達，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。
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轉染24 h后，在培養皿中加入終濃度為2~3 ug的嘌呤霉素進行篩選，一般篩選2~3天。
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用預熱的PBS洗去漂浮的死細胞及血清后，加入200 ul 1◊胰蛋白酶進行消化。
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加入2 ml 10%血清的培養基終止消化，然后轉移到無菌的15 mL離心管中。
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將細胞以800 x g離心3 min。
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將細胞沉淀重懸于5 mL10%血清的培養基中。
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計算血細胞計數器中活細胞的數量，以確定細胞密度。使用錐蟲藍排除死細胞，死細胞會吸收染料并變成藍色。
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在50 mL無菌離心管中，在40 mL完全生長培養基中將細胞稀釋至?1-2細胞/ 200 ul的密度。從起始懸浮液中進行10倍系列稀釋，以達到此細胞密度。
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將稀釋后的細胞鋪到96孔板中。為了保證能獲得敲除細胞，6孔板一個孔對應至少2個96孔板。
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3~5天后，在光學顯微鏡下觀察96孔板，對其中含有單細胞的孔進行標記。
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等到孔中的細胞密度達到70%~90%，用20 ul的1◊胰蛋白酶進行消化。
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加入200 ul 10%血清的培養基終止消化。吸取100 ul的細胞懸浮液，轉移至1.5 ml EP管中。剩余的細胞懸浮液留在96孔板中繼續培養。
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使用CRISPR/Cas9 genotyping試劑盒處理收集的細胞，用之前設計的PCR引物進行擴增，并將擴增產物進行測序。
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根據測序結果，篩選具有有效突變的單克隆。
單克隆細胞的擴增
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待陽性克隆細胞匯合度達到 70％以上時，依次轉至 48 孔板，24 孔板，12 孔板，6 孔板中擴大培養。
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記錄單克隆細胞的生長情況，評估細胞系的穩定性。
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用目的基因對應蛋白的單抗檢測細胞的表達產物，裂解細胞，提取細胞的總蛋白，SDS-PAGE 電泳后轉印到 PVDF膜上，封閉液封閉 1h 后，用一抗二抗先后孵育，化學發光成像儀下拍照分析。
圖4. 單克隆敲除驗證。
支原體檢測及細胞凍存
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用支原體檢測的試劑盒檢測細胞培養的上清液，PCR 鑒定，檢查細胞是否遭到支原體污染。
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將擴增后的穩定敲除細胞進行凍存。
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參考文獻：
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