慢病毒的結構
慢病毒雖然屬于逆轉錄病毒科的一種，但其結構和基因組的復雜程度遠超其他逆轉錄病毒。這也使得慢病毒具有獨特的整合機制和病毒感染持久性。
慢病毒整體大小約100nm，在病毒載體中屬于體積較大類型。其包裝容量一般在4.5-5kb左右，能夠滿足一般的細胞治療需求。
目前細胞治療中所使用的慢病毒載體來源于HIV-1，其原型包含九個關鍵病毒基因，分別是：gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、nef。其中gag基因可以編碼病毒所需的核心蛋白；pol基因編碼病毒復制所需要的酶；env基因編碼病毒的包膜糖蛋白。這三個基因編碼結構蛋白和蛋白酶，是保證病毒復制能力的關鍵基因，并且可以決定病毒感染宿主的靶向性。在病毒表達的過程中還需要一些順式作用元件，包括長末端重復序列（LTRs）、TAT 激活區（TAR）、剪接供體和受體位點、包裝和二聚化信號（Ψ）、Rev 反應元件（RRE）以及中央和末端多聚嘌呤區（PPT）等[1]。理論上，我們需要在兩端的LTRs中間插入我們需要慢病毒表達的目的基因，送入靶細胞之中并表達來實現外源基因的表達。
從結構上看，慢病毒與 Mulv 逆轉錄病毒載體相比，更傾向于整合到宿主基因組遠離轉錄起始點的位點的非活性轉錄區域中，其激活原癌基因沉默的風險低于 Mulv 逆轉錄病毒載體。
慢病毒作為細胞治療的載體的優勢：
- 更有效、更廣泛地感染分裂及非分裂的細胞、組織；
- 更大的包裝容量；
- 更低的細胞毒性和免疫原性；
- 更好的表達效果。
但是與此同時，由于慢病毒存在復制能力，在作為細胞治療的載體過程中需要最大程度地降低其成瘤性和致瘤性，對慢病毒載體的安全性進行優化。
第一代
基于 HIV-1 的慢病毒載體將載體組分成三個質粒以增加安全性：
1. 包裝質粒：包裝載體含有除包膜蛋白編碼基因的全病毒基因組，使用CMV啟動子進行表達，并用人胰島素基因的polyA替代3’LTR作為加尾信號，包裝質粒上的包裝信號或 LTRs 刪除，來減少載體制劑中復制型感染性慢病毒（RCLs）的產生；
2. 編碼病毒糖蛋白的 Env 質粒（包膜質粒）：包膜蛋白單獨置于一個質粒中進行表達；
3. 轉移質粒（載體質粒）：外源插入片段以及所有相關順式作用元件置于外源表達載體中[2]。
第二代
包裝系統刪掉了包裝質粒中HIV的所有附屬基因vif、vpu、vpr和nef，以減少產生RCL的風險。這些附屬基因的去除并不影響病毒的滴度和轉染能力，同時增加了載體的安全性[3]。
第三代
包裝系統進一步升級，由四個質粒組成。此系統將原來的一個包裝質粒分成兩個質粒：一個編碼 rev基因 ，另一個編碼 gag 和 pol基因，包裝質粒與任何表達慢病毒載體沒有顯著同源性，最大程度減少三個基因同時整合的可能性。通過將轉移質粒 5'LTR 的 U3 啟動子區替換為來自 CMV 或 RSV 的強病毒啟動子構建 tat 非依賴性的質粒，用異源啟動子序列取代tat基因后，原型HIV基因組中的9個基因在慢病毒載體中只保留了3個（gag、pol和rev）[4]。刪除了U3區的3'LTR的慢病毒顆粒在轉導、整合到靶細胞的基因組 DNA 中后自我失活，通過構建自身失活的慢病毒載體，使載體失去HIV-1增強子及啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉錄出RNA；第三代系統有效地減少了 RCLs 的產生并提高了生物安全性。
圖1：第一（A）、二（B）、三（C）代包裝系統
有研究表明，在某些情況下四質粒系統出毒略低，成本更高。安必奇生物從工藝到質控，全方位提升準確性和安全性，提供定制病毒包裝服務。
【參考文獻】
1. Trono, D. Lentiviral Vectors (Berlin-Heidelberg, Springer-Verlag, 2002).
2. Sakuma, T., Barry, M. A. and Ikeda, Y. (2012) Lentiviral vectors: basic to translational. J. Biochem. 443, 603–618.
3. Zufferey R, Nagy D, Mandel R J, et al.（1997）. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15，871-875.
4. Dull T, Zufferey R, Kelly M, et al. (1998). A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72, 8463-8471.