我已經做過很多次NGS了，標準流程也都有了，為什么還需要進行性能驗證？

作為全球**的分子診斷標準品研發生產商，菁良常常收到這樣的提問，NGS除了受人員、場地、儀器/試劑、操作流程等因素影響以外，由于整個過程涉及的環節太多，每一步驟都容易產生誤差影響最終的檢測結果。

影響NGS性能的因素

國家衛計委張瑞博士的報告中對為什么要進行NGS的性能驗證做了詳細描述。
1. 樣本提取效率低
2. 自動化提取可能會導致樣本交叉污染
3. 文庫構建標簽或者接頭可能無效連接
4. 探針捕獲效率低
5. PCR過程產生較大偏倚
6. 測序儀本身有一定的測序錯誤率
7. 測序儀光路偏倚，導致測序堿基質量低
8. 變異檢測錯誤
9. 加入的標簽識別錯誤
10. 實驗室污染，人員能力差異，
11. 選用的軟件錯誤，例如GATK Indelocator不能檢測超過20個核苷酸的插入缺失
12. 注釋差異，注釋錯誤
13. 體細胞突變不能有效識別，未能精確過濾胚系突變
14. 數據分析參數設置不理想，數據過濾太多

上述一系列的原因，導致使用不同的流程，不同的實驗室做出來的結果，測序質量和信息分析的結果不盡相同。

2015年實體腫瘤體細胞突變高通量測序檢測能力調研結果

在2015年的實體腫瘤體細胞突變高通量測序檢測能力調研中，也發現下列結果：

? 16.7%（12/72）實驗室完全正確

? 449個錯誤結果

? 201個假陰性結果（201/449,44.8%）

? 222個假陽性結果(222/449,49.4%)

? 26個小錯誤(26/449,5.8%)

解決方案

面對以上諸多的影響NGS性能的因素，我們要從哪些方面進行驗證呢？
張博士在報告中給出了詳細的建議，作為全球**的分子診斷行業標準品研發生產商，菁良也給出了相應的解決方案。

1. 精密度:突變結果是可以重復檢出的嗎？
菁良基因解決方案：

? 使用同一批次的菁良基因FFPE標準品，分多次提取，驗證提取效率；

? 使用同一批次的菁良基因gDNA/ctDNA/RNA/fcDNA，重復建庫，通過相同的文庫檢測指標，來衡量建庫重復性；

? 使用同一批次的菁良基因gDNA/ctDNA/RNA/fcDNA，一次建庫，分批次上機，驗證測序重復性；

? 相同的提取，建庫，測序條件，使用不同的信息分析流程，驗證流程的重復性；

2. 準確性:突變檢測結果是正確的嗎?陽性的結果能檢出陽性,陰性的結果能檢出陰性嗎?
菁良基因解決方案：

• 使用已知突變位點，突變類型，突變頻率的菁良基因陰陽性標準品，來驗證檢測結果的準確性。

3. 分析敏感性-檢測下限：能正確檢出最低多少濃度的突變位點?
菁良基因解決方案：

• 通過低頻的菁良基因gDNA，ctDNA標準品，例如2.5% 腫瘤SNV gDNA標準品，和將要推出市場的ctDNA（可檢測低至0.1%）套裝，分梯度檢測流程下限。

4. 分析特異性-干擾物質:某些物質是否會對結果產生影響?
菁良基因解決方案：

• 將菁良基因標準品摻入別的干擾物質，例如：1% 腫瘤結構變異ctDNA標準品，摻入正常人血漿。

5. 可報告范圍：能夠可靠檢出突變的區域?
菁良基因解決方案：

• 菁良基因的gDNA，ctDNA標準品突變位點，分布于不同的外顯子區域，根據檢測結果準確性，可以大致判斷檢測范圍。