目前針對帕金森病的潛在治療方法大多集中于直接靶向 α?突觸核蛋白，但臨床研究仍處于早期階段。α?突觸核蛋白由 SNCA 基因編碼，研究表明，該基因中的錯義突變(missense mutations)及單核苷酸多態性(SNPs)均與增加帕金森病發病風險相關。因此，賽諾菲(Sanofi)基因醫學部的研究人員開展研究，評估利用腺相關病毒(AAV)介導的人工 microRNA(amiRNA)降低 SNCA 表達的治療效果。
Elmer 等人在一項 α?突觸核蛋白病的預成纖維(pre?formed fibril，PFF)模型中系統評估了 amiRNA 靶向 SNCA mRNA 的治療潛力，并在體內與體外體系中對 amiRNA 進行優化，以推動其向臨床轉化。
● 研究人員首先進行了劑量范圍研究，以確定 AAV 介導的 amiRNA 所需的劑量，從而實現對小鼠 SNCA 基因表達 50% 的降低。他們最初在野生型小鼠中評估靶基因的下調效果，隨后在接受 StressMarq 小鼠重組 α?突觸核蛋白 PFF(目錄號：SPR?324)雙側紋狀體注射的小鼠中重復實驗，以誘導 α?突觸核蛋白病理。
● 本研究使用了 AAV?PhPeB 載體，這是一種在嚙齒類動物中被驗證具有良好腦穿透能力的衣殼類型。野生型小鼠被給予三種劑量的與小鼠 Snca 序列具有同源性的 amiRNA (amiRmSYN)，或給予對照 amiRNA(amiRCTL)。結果顯示，最高劑量的 amiRmSYN 達到了預期目標，使 Snca 表達下降約 50%，并因此被用于后續的帕金森病理小鼠模型實驗。
● 研究中還使用了 StressMarq 小鼠重組 α?突觸核蛋白單體(目錄號：SPR?323)作為對照。由于在 1.5 個月和 3 個月時觀察到的運動功能缺陷極為輕微，研究結果主要依賴神經病理學指標來評估治療效果。。研究流程為：小鼠首先接受編碼 amiRmSYN 或 amiRCTL 的 AAV 處理，隨后在一個月后注射 α?突觸核蛋白單體或 PFF。注射三個月后收集腦組織進行分析。
● 與野生型小鼠的觀察結果一致，amiRmSYN 的治療使目標 mRNA 下調約 50%。此外，使用 amiRmSYN 進行 α?突觸核蛋白敲低顯著減少了 pSer129 病理的誘導。相反，接受 α?突觸核蛋白單體或 PFF 并結合對照 amiRCTL 的實驗對象，其 Snca 表達并未出現改變。
● 在驗證 AAV 介導的 amiRNA 治療的概念驗證(proof of concept)后，研究團隊將研究重點轉向優化這些 amiRNA，使其能夠用于未來針對人類的潛在治療。通過生物信息學篩選 (in silico down selection)，研究者獲得了14 條候選 amiRNA。隨后使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)對這些序列進行了評估，結果顯示它們均可降低 α 突觸核蛋白水平。
● 研究人員接著在 HeLa 細胞中開展劑量反應實驗，分析此前篩選出的 5 條 amiRNA。其中有 3 條的表現優于先前用于 PFF 小鼠模型的 amiRmSYN，提示其在人類 PD 模型中具有潛在的良好效果。
● 基于這些結果，Elmer 等人進一步嘗試通過串聯(concatenation) 的方式增強 amiRNA 的 SNCA 敲低效果。他們確定了 4 條 amiRNA 的母本向導鏈(parental guide strands)，并基于每條向導鏈構建了表達雙拷貝（“2X”）或三拷貝(“3X”) amiRNA發夾結構的串聯變體。天然的 miRNA 經常以包含多個發夾結構的串聯形式存在，而人工串聯也已被證實是增強靶標抑制的有效策略。
● 此外，研究團隊還評估了在這些發夾結構之間改變間距是否會影響效力。他們在 2X 和 3X 變體中加入不同長度的 spacer，并將其效力與非串聯的單拷貝(“1X”)設計進行比較。通過將 amiRNA 質粒轉染入 HeLa 細胞以測量 SNCA 敲低效果，結果顯示幾乎所有 2X 與 3X 變體均優于 1X 的設計。研究還發現，串聯對向導鏈加工的影響非常有限。
● 研究團隊的下一步目標，是在體內模型中評估串聯 amiRNA 對人源 α 突觸核蛋白的敲低效果。為此，研究人員使用了由 Michael J. Fox 基金會開發的轉基因小鼠品系，由于該轉基因小鼠在基因組中整合了人源 SNCA，它能夠有效接受針對 SNCA mRNA 的靶向性干預。研究人員利用 AAV 衣殼將 amiRNA 注射至小鼠紋狀體，并在注射六周后收集紋狀體組織。與此前結果一致，3X 變體中更高水平的 amiRNA 表達導致 Snca 水平顯著降低。
● 最后，該研究通過組合方法評估 SNCA 下調的下游影響。研究采用了差異基因表達(DEG)分析、交聯(cross linking)、免疫共沉淀(immunoprecipitation)以及 RNA 測序多種技術的整合手段。該組合技術此前已用于 miRNA: mRNA 互作的定量分析。在這一研究中，研究人員識別出 1 條具有非靶向作用的母本 amiRNA，以及 3 條未發現明顯非靶向效應的母本向導鏈。
Elmer等人的研究評估了AAV介導的人工miRNA(amiRNA)在阻斷致病性α突觸核蛋白傳播方面的有效性。他們在多種設置中進行了驗證，包括體內與體外模型, 并同時針對嚙齒類與人源SNCA基因進行敲低，從而降低Snca表達, 最終達到阻斷帕金森病模型中病理擴散的目的。這些發現為帕金森病治療提供了新的潛在機制, 并將50%的SNCA下調幅度確立為未來amiRNA研究的重要目標基線。
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參考資料
● Artificial miRNA mediated reduction of SNCA for the treatment of α-synucleinopathies. Elmer, B. et al., Mol Ther. 2025
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