CUT&RUN的8個基本步驟

CUT&RUN只包含幾個基本步驟！

具體信息請見下方~

步驟1：分離細胞并固定到刀豆蛋白（ConA）磁珠上

將細胞（或細胞核）與ConA包被的磁珠結合，ConA是一種與細胞表面蛋白結合的凝集素。該步驟不僅支持高通量方法，而且簡化了后續從染色質片段里分離細胞的操作。

避免磁珠干燥或結塊在本步驟中非常重要，因為這會導致樣品損失并降低產量。關于確認細胞完整性及與ConA磁珠結合情況的重要質量控制檢查信息，可以點擊此處獲取。除此之外，高質量的樣本準備對CUT&RUN的成功也至關重要，某些類型的樣本可能需要進行一定處理后方可使用，詳情可點擊Sample Prep查詢。

步驟2：透化細胞

由于洋地黃皂苷是一種非離子生物洗滌劑，可在低濃度下透化細胞膜。因此，在本步驟中使用含有洋地黃皂苷的緩沖液對固定好的細胞進行透化處理。透化處理對于抗體與pAG-MNase的結合至關重要，并且為后續MNase消化獲得的DNA能夠擴散到溶液中提供先決條件。洋地黃皂苷的用量必須根據所用細胞的類型進行優化，以免在實驗中細胞出現裂解或不完全透化的情況，關于優化處理的詳細信息，請點擊此處了解。

步驟3：加靶標特異性抗體孵育

將目標靶標的抗體添加到反應中，并在4℃下孵育過夜。我們建議每個實驗中設置陰性對照（如IgG）和陽性對照（如H3K4me3）反應。

抗體的特異性和結合效率對于CUT&RUN的成功至關重要。事實上，這種檢測的背景非常低，以至于低效率的抗體無法達到足夠高的產量進行PCR和測序。相反，非特異性抗體可能會提供相當好的產量，但會導致錯誤的生物學解釋。詳情參考抗體選擇和檢測控制的附加說明。

步驟4：pAG-MNase結合

第二天，洗滌與磁珠結合的細胞，除去未結合及非特異性結合的抗體。在沒有鈣離子（Ca2+）存在的條件下，將pAG-MNase添加到反應體系中，以防止MNase的過早激活。pAG的免疫球蛋白結合特性會將MNase“栓”在抗體結合的染色質上。pAG-MNase孵育后，多次洗滌細胞/磁珠混合物，以去除過量的pAG-MNase，防止非特異性切割。

步驟5：pAG-MNase激活

向反應中加入Ca2+以激活MNase，MNase會在抗體結合處的兩側切割DNA。被切割下來的片段擴散至上清液中，而剩余的大塊染色質保留在磁珠固定的細胞內。

由于MNase是一種加工酶，所以必須終止反應，以防止釋放的DNA片段被過度消化掉。pAG-MNase孵育后，加入含有EDTA和EGTA的Stop緩沖液以螯合游離鈣離子并終止酶活性。短暫加熱反應體系以降解RNA，并將剩余的染色質片段釋放至溶液中。

步驟6：DNA純化

因為細胞仍與磁性ConA珠結合在一起，所以CUT&RUN富集DNA的分離很簡單。利用磁性，將含有大量染色質的磁珠偶聯細胞與剪切下的目標DNA片段分離開，目標DNA被留在溶液中。目標DNA片段純化后，通過熒光測定（例如ThermoFisher QubitTM）進行定量。

DNA產量一般不作為表明CUT&RUN成功的指標，相反，當目標是~5 ng DNA時，后續CUT&RUN文庫制備的效率較高。由于原始的CUT&RUN DNA產量通常低于Bioanalyzer / TapeStation的檢測極限，所以不建議使用這些方法在Bioanalyzer / TapeStation上分析原始的CUT&RUN DNA。

EpiCypher還檢測了陽性對照和實驗靶標高于IgG陰性對照反應的產量（即使只是略高）。根據概述的指標確認好DNA質量后，即可進行下一步的文庫構建。

步驟7：CUT&RUN文庫構建

將修復純化的CUT&RUN DNA連接到測序adapter上，并進行PCR擴增以生成測序文庫。PCR擴增使用了針對CUT&RUN低產量和小片段規格的優化參數，條形碼引物用于實現多路測序。EpiCypher的Library Prep Kit經過專門優化，可以進一步簡化您的工作流程。

在測序之前，確認CUT&RUN成功的最佳方法是對純化文庫進行片段大小分布的分析。使用毛細管電泳（例如Agilent Bioanalyzer或TapeStation）確認CUT&RUN文庫的片段大小分布和濃度。由于MNase將片段消化到核小體水平的分辨率，所以平均峰值一般約為~300 bp（~170 bp的片段DNA+adapter）。有關確保測序文庫質量的更多詳細信息，請參閱該文。

步驟8：Illumina®下一代測序

文庫以等摩爾比例匯集，并加載到所需的平臺上進行測序。每個樣本只需要300-800萬次讀取，就可以獲得背景上的穩健信號（相比之下，ChIP-seq則需要超過2000萬次讀?。?，并且允許用戶在單次運行中多路傳輸10-100個樣本。

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EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學公司。從專有組蛋白肽陣列平臺EpiGold™開始，EpiCypher開發了一系列同類產品。同時，EpiCypher是重組核小體制造和開發的全球領導者。利用其獨有技術，不斷添加高純度修飾重組核小體（dNucs™）產品。dNuc™多樣性的產品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發提供了強大的工具。

EpiCypher還將dNuc™技術廣泛的應用于多種分析測定產品中，包括：SNAP-ChIP®Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne®底物（用于染色質重塑和抑制劑篩選及開發），dCyher™測定（用于探究表觀遺傳蛋白質-組蛋白PTM結合相互作用）。最近，EpiCypher還推出了針對ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA™分析。

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