來源：華中農大

目前，如何在細胞內高效且特異地引入單核苷酸突變成為基因編輯的重大研究方向。CRISPR/nCas9/dCas9技術融合胞嘧啶脫氨酶的堿基編輯系統自研發以來被廣泛關注，該系統不需要產生DSB和提供DNA模板就能有效地替代基因組中的特定堿基。堿基編輯器包含Cas9 蛋白變體、胞嘧啶脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）（圖1 單堿基編輯示意圖）。

CRISPR/Cas9作為一種新型的基因編輯技術，被廣泛應用于多種物種的基因組編輯研究。由于低效率的同源重組修復及無法預期的編輯類型，CRISPR/Cas9技術多用于基因敲除的研究。

圖1 單堿基編輯系統工作示意圖

2019 年 5 月 22 日，Plant Biotechnology Journal 雜志在線發表了華中農業大學棉花遺傳改良團隊題為 "High Efficient and Precise Base Editing of C?G to T?A in the Allotetraploid Cotton (Gossypium hirsutum) Genome Using a Modified CRISPR/Cas9 System " 的研究論文，該論文利用Cas9 缺口酶(nCas9)，胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構建了適用于棉花遺傳轉化的堿基編輯系統（GhBE3）。實現了在棉花細胞內高效且特異地引入單核苷酸突變，具有很高的C?G to T?A 的單堿基編輯效率，并且可以進行穩定的遺傳轉化。

在此之前，華中農大棉花團隊已經發表了3篇關于棉花基因編輯的研究論文，系統的對棉花中不同方式的基因編輯進行了研究：2017 年建立了國際上最早的棉花編輯系統之一，該系統使用了棉花內源的U6啟動子和合適的抗生素篩選標記，使得CRISPR/Cas9技術在異源四倍體棉花中的應用具有高效特異的編輯；2018 年利用高通量測序的方法，揭示了在CRISPR/Cas9編輯的棉花植株中，脫靶突變很少，更多地是受體材料固有遺傳或/和體細胞無性系變異；2019年分析了 Cpf1 ( Cas12a ) 蛋白在棉花異源四倍體中的編輯作用，具有很高的編輯效率，并且沒有發現脫靶效應。

在本研究中，作者利用Cas9 缺口酶(nCas9)，胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1），尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）構建了適用于棉花遺傳轉化的堿基編輯系統（GhBE3）。選擇兩個內源基因（GhCLA, GhPEBP），設計了三個靶標（sgRNA1, sgRNA2靶向GhCLA基因, sgRNA3靶向GhPEBP基因），構建單堿基編輯載體并通過農桿菌介導進行棉花遺傳轉化。發現在棉花中靶標基因 GhCLA, GhPEBP的三個靶標均被編輯，而且C-T的編輯效率達到57.78%，以靶標位點上多個C位點同時編輯為主；該系統在靶標序列上的“編輯窗口”為6個堿基（PAM序列遠端5 '端3 - 8的位置），且 “編輯窗口”內C-T替換效率在總DNA序列中達到18.63％，靶標序列編輯窗口內的C-T編輯效率遠高于其余部位C-T替換的效率（圖2）。

圖2 GhCLA和GhPEBP基因靶標位點編輯檢測及窗口內位點的突變檢測

研究人員利用深測序檢測27個潛在脫靶位點，在潛在脫靶位點的編輯窗口內發生C-T替換比例均低于0.1%，統計分析后堿基編輯的植株和野生植株沒有脫靶效率的差異。此外，將兩個GhCLA 基因編輯的單株和一個野生（Jin668）植株進行100×深度的全基因組測序以檢測脫靶效應。在從全基因組水平預測的1500個潛在脫靶位點上沒有發現脫靶突變，這表明單堿基編輯系統對棉花的基因組編輯具有較強的特異性（圖3）。

圖3 GhBE3系統在棉花中的全基因組測序

該CRIPSR單堿基編輯系統在異源四倍體棉花中首次應用，具有較高的C?G to T?A 的單堿基編輯效率和特異性，它將成為棉花功能基因組研究新的重要的技術手段。
華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室金雙俠教授為該論文的通訊作者，已畢業的碩士秦雷為第一作者，張獻龍教授也參與了這項工作。該研究受到國家重點研發計劃 ( 2016YFD0100203-9 ) 和科技部轉基因植物研究與產業化專項 ( 2016ZX08010001-006 ) 和中央高?？蒲薪涃M ( 2013PY064,2662015PY028,2662015PY091 和 0900206328 ) 的支持。

論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13168

北京安必奇生物科技有限公司始終走在科學前沿，我們提供CRISPR單堿基編輯和CRIPSR/Cas9基因編輯服務，致力于更好地服務植物遺傳轉化研究。