穩定細胞系是指將外源基因整合到宿主細胞基因組中，使外源基因能夠在宿主細胞中長期穩定表達，這樣的細胞系稱為穩定細胞系。其原理是將外源基因克隆到具有某種抗性的載體上，通過轉染宿主細胞，外源基因整合到宿主染色體上，用載體中所含抗性基因進行篩選即可得到成功整合目的基因的細胞。在試驗過程中，常用的真核表達載體抗性篩選標志物有嘌呤霉素（puromycin）、新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）等。通過篩選可得到符合實驗要求的穩定高表達目的蛋白細胞株或者穩定沉默目的基因的細胞株。

利用慢病毒感染篩選單克隆是目前較常用的穩定細胞系構建方法之一。慢病毒可以感染幾乎所有類型的細胞，并且可以將遺傳物質整合到宿主細胞基因組中，進行長時間的穩定表達。

圖 1. 使用慢病毒產生穩定細胞系的示意圖 （Neha Tandon. 2018）

實驗流程及注意事項

1）根據實驗目的選擇合適的載體

可根據載體抗性、啟動子類型、可溶和表達熒光蛋白（GFP/RFP等）、是否需要篩選穩轉株等選擇合適的載體。

2）構建/選擇高效的慢病毒載體

理論上慢病毒系統對外源片段容量能到8 kb，扣除啟動子，篩選抗性基因等，應該還能容納4 kb。但實際上2 kb以上的外源基因包裝病毒產量就比2 kb以下的少很多。在做正式實驗之前，可先進行小量包裝，成功后再進行病毒大量包裝。對于knockdown，通常是對一個基因同時選擇3個（或以上）干擾靶點，通過qPCR驗證干擾效率之后，選擇效率最好的靶點進行下一步實驗。

1） 取狀態良好，處于對數生長期的293T細胞進行慢病毒包裝。

2） 細胞鋪板：再轉染前24 h進行細胞鋪板（根據實驗需求選擇合適的培養皿），轉染時細胞密度控制在80%左右。（注意：鋪細胞時可左右輕輕搖晃培養皿，以使細胞均有分布在培養皿中。）

3） 轉染：取高質量質粒（包括慢病毒包裝質粒和慢病毒載體）進行轉染。轉染完畢放入培養箱中（從生物安全考慮，應將慢病毒包裝用的培養箱和普通細胞培養箱分開，培養條件一致）。

由于細胞已開始包裝病毒顆粒, 之后的所有操作必需在生物安全柜內小心完成！

4） 換液：轉染6~8 h后，將培養皿中的培養液移棄，加入新鮮的適量的培養液。

5） 收集慢病毒顆粒上清：根據實驗需要，可收集轉染后48 h/72 h的慢病毒顆粒上清。

6） 濃縮：若需要進一步提高慢病毒的滴度，可將收集好的慢病毒顆粒上清進行超速離心（50000 g， 2 h，4℃）。小心移去上清，用少量PBS或培養基溶解慢病毒顆粒（4℃，>2 h）。（注意：超速離心前可先低速離心以去除細胞碎片：3000 g，5 min）。

7） 保存：若直接保存慢病毒顆粒上清，低速離心后便可保存；若保存濃縮后的慢病毒顆粒，高速離心后直接保存即可。4℃可保存一周左右，長時間保存需要放置于-80℃。反復凍融會影響慢病毒的感染效率，建議進行分裝保存。

1） 轉染前18-24小時進行鋪板，轉染時細胞密度控制在80%左右。

2） 第二天加入適量病毒懸液。37℃孵育。

3） 繼續培養24小時，用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。

4） 繼續培養。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉染48小時后可見明顯熒光表達。在轉染3-4天后開始加藥篩選。

1） 實驗中的關鍵點

●要確保有效的 ShRNA 慢病毒載體

●慢病毒表達載體的質量

●狀態良好無污染的293T細胞系——直接影響慢病毒顆粒的產率

2）生物廢棄物的處理

●雖然用于慢病毒包裝的質粒均已經過改造, 使其盡可能具有較大的生物安全性。但由于其可以和內源性的病毒重組，形成一個可以自我復制的病毒, 故仍然具有潛在生物公害危險性。因此, 慢病毒包裝實驗處于NIH生物安全級別2級。

●在實驗過程中，仔細穿戴手套以及實驗服，操作小心規范，凡是涉及到慢病毒顆粒包裝的步驟, 均要在安全2級層流通風櫥下進行, 并且操作過程中要盡量降低氣溶膠的產生, 一旦有含病毒顆粒的液體濺出，一定要及時清理臺面。

●所有相關的培養基及廢棄物在棄置前需要高壓滅菌方法滅活。在帶離實驗區前, 需要在有標記的(生物公害, 有傳染性垃圾)容器內密封后方可帶出。

參考文獻

1. Neha Tandon,. et al. Generation of Stable Expression Mammalian Cell Lines Using Lentivirus. Bio Protoc. 2018; 8(21): e3073.

2. Kailin Xu. et al. Generation of a Stable Cell Line Producing High-Titer Self-Inactivating Lentiviral Vectors. Molecular Therapy. 2001. 3(1):97-104