什么是AAV？

腺相關病毒AAV（Adeno-associated virus）屬于細小病毒科，是很小的單鏈和非包膜DNA病毒之一，僅由核酸和蛋白衣殼組成。正因為病毒的結構簡單，所以它需要寄生在活細胞內才能進行繁殖。由于需要進入活細胞內繁殖，所以病毒都練就了一身破膜進入胞內的本領。基于這種能力，科學家開發了病毒基因傳遞系統。該系統利用病毒作為載體，可以把外源治療基于帶到細胞內部完成基因治療的關鍵步驟。目前比較成熟的病毒基因傳遞系統主要包括逆轉錄病毒(RV)、腺病毒(AdV)、腺相關病毒(AAV)、慢病毒(LV)和單純皰疹病毒(HSV)。

AAV的基因組

通過基因組研究發現AAV有一個大約4.7 kb的線性單鏈DNA (ssDNA)基因組，在末端有兩個145個核苷酸長反向末端重復(ITR)。該病毒不編碼聚合酶，因此依賴于細胞聚合酶進行基因組復制。ITRs位于兩個病毒基因rep（復制）和cap（衣殼）的側面，分別編碼非結構蛋白和結構蛋白。cap基因通過選擇性剪接和翻譯起始，分別產生三種衣殼蛋白VP1（病毒蛋白1）、VP2和VP3。這些衣殼蛋白組裝成60個亞基的近球形蛋白外殼。rep基因通過兩個啟動子和選擇性剪接，編碼四種調節蛋白，分別稱為Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。這些蛋白參與了AAV基因組的復制。

圖1. AAV2的基因圖譜

AAV的特性

作為本次介紹的主角，AAV具有與其他病毒基因傳遞系統不同的三大主角光環：1 AAV在感染人類和其他靈長類動物時只能在體內引起非常輕微的免疫反應；2使用AAV作為基因治療載體時不僅可以感染正常分裂的細胞，而且還可以感染休眠的細胞；3進入細胞的AAV裝載的核酸可以不整合到基因組上，進而保持染色體外狀態，這樣可以防止由于外來基因片段插入造成基因組不穩定。這些特性使AAV成為基因治療、病毒載體和人類同基因疾病模型的誘人的候選對象。

AAV的特性是如何產生的呢？

野生型AAV由于其諸多特性，引起了基因治療研究者的極大興趣。那這些特性是如何產生的呢？其中關于AAV裝載的核酸可以不整合到基因組上這一特性已經研究的比較清楚。研究發現一般天然AAV可以穩定地整合到人類19號染色體的一個特定位置（AAVS1）。這一特性使它比具有隨機插入和誘變威脅的逆轉錄病毒更可預測。而有趣的是，AAV還可以通過從載體的DNA中去除rep和cap序列來消除這種整合能力進而使裝載的DNA不會整合到基因組中。通過宿主細胞DNA聚合酶復合物將單鏈載體DNA轉化為雙鏈后，在倒末端重復序列(ITR)之間插入一個驅動基因轉錄的所需基因和一個啟動子，倒末端重復序列有助于在細胞核內形成連接體。在未分裂的細胞中，這些結合物在宿主細胞的生命周期中保持完整。

如何選擇AAV血清型?

研究發現，AAV有多種血清型。不同血清型的AAV載體之間的主要區別是衣殼蛋白不同。目前，基因傳遞中最常見的AAV血清型為AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9。不同的血清型對不同細胞和組織的轉染效率不同。因此，選擇合適的AAV血清型至關重要。

通過臨床實驗結果表明: AAV1對肌肉、肝臟和血管內皮的感染更優；AAV2對骨骼肌、神經元、血管平滑肌細胞、肺泡細胞和肝細胞具有天然的趨向性；AAV5在小鼠氣道和肺泡上皮細胞的轉化效率較AAV2高；AAV6載體在大氣道和小氣道的上皮細胞轉導效率AAV2高；AAV8型顯示出更大的肝臟轉導效率；AAV9具有跨過血腦屏障的能力。所以在選擇AAV血型的時候，需要考慮我們轉化的組織和細胞的特性，然后確定合適的AAV類型。

圖2. 基因轉移最常用的AAV載體以及其天然趨向性。

如何檢測AAV制劑的質量

當完成AAV制劑之后，我們不能直接拿來使用。因為只有通過質量檢測合格的制劑，我們才能保證后續實驗的成功。目前，對AAV制劑進行鑒定的方法主要包括：滴定ELISA、qPCR、ddPCR、DNA斑點雜交、轉換單元的測定、感染中心測定、SDS-PAGE或電鏡等。qPCR已被廣泛使用，但仍存在一些問題，例如樣品制備，引物設計或PCR效率，這些問題可能導致實驗室間結果之間的高度差異。數字液滴PCR方法克服了qPCR的某些局限性。但是，由于不同的樣品處理方案，實驗室之間仍然可能發生變化。如果使用可靠的參照，則斑點印跡是一種簡單且定量的方法。然而，它通常受蛋白質印跡的線性和動態范圍的限制?？紤]到上述技術的實際缺陷，目前常規的夾心ELISA在實驗室間和實驗室間的變異以及易于使用方面似乎是優越的。因此，它代表了可靠和可再現的總rAVV衣殼滴度定量的很好的方法。

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我們提供基于夾心法ELISA的AAV滴度檢測試劑盒和不同亞型的AAV抗體，可特異性識別完整的病毒衣殼；腺相關病毒亞基或AAV復制酶。

參考文獻：

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