<p>上一篇中，我們介紹了<a href="https://www.abace-biology.com/quantitative-untargeted-proteomics-analysis-methods.htm" data-cke-saved-href="https://www.abace-biology.com/quantitative-untargeted-proteomics-analysis-methods.htm">非靶向蛋白組學定量技術</a>，這期，我們來認識下靶向蛋白組學定量技術都有哪些呢？以及什么是SWATH技術？</p> <section data-tools="135編輯器" data-id="93695"> <section> <section></section> </section> </section> <section data-tools="135編輯器" data-id="89204"> <section> <section data-brushtype="text"><strong>靶向蛋白組學定量</strong></section> </section> </section> <p>非靶向蛋白組學定量技術受限于生物樣本的復雜性，低豐度的多肽信號容易被高豐度的所抑制，因此難以檢測低豐度的多肽，靈敏度低且具有隨機性，定量的重復性也較低。隨著蛋白組學研究的深入，差異蛋白組學越來越受到人們的青睞，差異蛋白分析能發現潛在疾病標志物，加快代謝組學的臨床應用步伐。靶向蛋白組學定量（又被稱為目標蛋白組學定量）技術可以彌補上述非靶向定量組學定量的不足，具有高通量、高準確性、可重復性的優點，基于早期的差異蛋白組/轉錄組/基因組的數據，在大生物樣本量中，驗證這些標志物。靶向蛋白組學定量主要包括MRM/SMR和PRM。靶向蛋白組學定量技術可用于信號傳導通路檢測、腫瘤標志物研究和翻譯后修飾研究，是基于抗體的蛋白定量技術以外的另一種快速、有效蛋白靶向定量技術。</p> <section data-tools="135編輯器" data-id="92984"> <section> <section> <section><strong>01 MRM/SRM</strong></section> </section> </section> </section> <p>多重反應監測技術(multiple reaction monitoring， MRM）在早期文獻中又被稱為選擇反應監測技術（selected reaction monitoring，SRM）。該技術本質上是一種質譜的掃描模式，基于目標蛋白的特定母離子和子離子對，選擇采集符合目標離子規則的信號，去除不符合規則的信號干擾，進行高靈敏度、高準確性和特異性的靶向蛋白定量。MRM質譜分析主要包括三個階段：（1）一級質譜掃描篩選出與目標分子特異性一致的母離子;（2）碰撞碎裂母離子，去除干擾離子；（3）只采集來自選定的特異離子的質譜信號?？梢曰诶碚擃A測（如MRMpilot等軟件）或者真是實驗結果選擇母子離子對。</p> <p><img style="width: 600px; height: 193px;" src="https://img1.dxycdn.com/2019/0902/362/3365978890115448476-14.jpg" alt="" data-cke-saved-src="https://img1.dxycdn.com/2019/0902/362/3365978890115448476-14.jpg" /></p> <p>圖1. 三重四極桿質譜儀進行MRM掃描示意圖。</p> <p>該技術很大限度排除了其他離子的干擾影響，顯著提高了靶向肽段的信噪比和對目標肽段定性和定量檢測的靈敏度和可重復性，被認為是基于質譜技術的蛋白定量的&ldquo;金標準&rdquo;，特別適合進行標志蛋白的高通量監控。通過在樣本中加入已知含量的同位素標記肽段作為內參，MRM技術還可用于目標蛋白的絕對定量。MRM技術可以和多種定量策略聯用，蛋白組學實驗通常包含大量的分離富集步驟，因此越早加入內標能更好的降低實驗誤差。另外MRM適合多種質譜儀，如高分辨率質譜儀（Q-TOF，orbitrap， FT-ICR，能區分ppm級別的質量差異）和低分辨率質譜儀如三重四極桿質譜儀。</p> <section data-tools="135編輯器" data-id="92984"> <section> <section> <section><strong>02 PRM</strong></section> </section> </section> </section> <p>平行反應監測技術（parallel reaction monitoring, PRM）是MRM的衍生技術，也可在復雜生物樣品中同時對多個目標蛋白進行相對或者絕對定量檢測。PRM采集目標肽段的高分辨率MS2質譜圖，使用軟件對ppm級別的目標離子進行峰面積抽提，有效排除其他離子的干擾。與MRM相比，動態范圍更廣，精度更高靈敏度更強，重復性更好，抗背景干擾能力更強，實際操作更簡單，成本更低。PRM不需要預先根據目標蛋白設計母離子和子離子對，實現了對子離子的全掃描。PRM可替代Western blot技術，高通量地在大生物樣本量中驗證抗體，并可應用于多種非模式生物。</p> <p>PRM主要包括五個實驗流程：（1）從shotgun實驗或者根據理論推測選擇靶向肽段；（2）制備樣品的混合物；（3）預實驗調整參數和靶向肽段；（4）PRM檢測；（5）數據分析。PRM方法的不足之處是當待分析肽段的數量過大時，需要精細調整質譜采集參數，否則會大大影響定量數據的準確和精度。2015年，Gallien和同事設計了一種內標觸發平行反應監測技術(Internal standard triggered-parallel reaction monitoring，IS-PRM)，通過添加內標和實時調整采集參數來定量內源肽段，即使在分析大量肽段數據時也可使質譜結果始終保持高精準狀態。</p> <p><img style="width: 600px; height: 232px;" src="https://img1.dxycdn.com/2019/0902/252/3365978950244991804-14.jpg" alt="" data-cke-saved-src="https://img1.dxycdn.com/2019/0902/252/3365978950244991804-14.jpg" /></p> <p>圖2. SRM/MRM和PRM的實驗流程對比圖。</p> <section data-tools="135編輯器" data-id="89204"> <section> <section data-brushtype="text"><strong>SWATH/DIA</strong></section> </section> </section> <p>iTRAQ/TMT，SILAC，label free等蛋白定量方法都是基于數據依賴型采集（data-dependent acquisition，DDA）技術，即二級質譜只能采集一級譜圖中信號最強的top20，而在母離子選擇時，質譜偏向于掃描高豐度肽段。SWATH是一種新的質譜采集模式技術，它把數據非依賴采集（datain-dependent acquisition, DIA）和高分辨的靶向質譜數據提取相結合，能對目標蛋白進行檢測和定量。SWATH在DIA模式下，能夠將特定質量范圍內的所有前體離子打碎，采集所有碎片離子，并依次超高速掃描相鄰的母離子寬口內的所有碎片離子，獲得完整的肽段信息。</p> <p><img style="width: 500px; height: 165px;" src="https://img1.dxycdn.com/2019/0902/855/3365979021111953520-14.jpg" alt="" data-cke-saved-src="https://img1.dxycdn.com/2019/0902/855/3365979021111953520-14.jpg" /></p> <p>圖3. DDA、DIA和MRM的原理比較圖（DIA：隨機采集模式）。</p> <p>一次SWATH實驗就能獲得完整的蛋白定量和定性結果，無需方法優化。高分辨率的模式可以消除背景干擾，提高選擇能力、靈敏度和通量，針對亞細胞結構、微生物、細胞分泌物等樣本，SWATH的定量效果非常好。SWATH采集模式，不同于 MRM需要在數據采集前對目標肽段做方法開發，它可以直接采集數據，形成的電子文檔，方便今后隨時根據實驗需求挖掘更多的信息。利用免費（OpenSWATH24, Skyline25, PeakView）或者商用的軟件（Spectronaut）和蛋白組特定的方法庫，SWATH可以完全媲美 MRM 技術，并大大提高定量通量。SWATH主要應用于蛋白質組定量、蛋白復合體鑒定和宿主蛋白分析等</p> <section data-tools="135編輯器" data-id="94089"> <section> <section> <section data-width="25%"></section> </section> <section data-brushtype="text"><strong>推薦服務</strong></section> </section> </section> <p>安必奇蛋白組學專業團隊基于超高分辨率、高靈敏度的液相色譜-質譜聯用技術，可在細胞或組織類樣品中鑒定超過10000個蛋白，結合全面、驗證的生物信息學分析流程，為您構建高通量蛋白質定量表達譜。</p> <p><strong>服務內容</strong></p> <p><a href="https://www.abace-biology.com/Quantitative-proteomics.htm" data-cke-saved-href="https://www.abace-biology.com/Quantitative-proteomics.htm" data-linktype="2">蛋白質定量組學</a></p> <p>MMR</p> <p>SWATH</p> <p><strong>參考文獻</strong>：</p> <p>1. 基于質譜的定量蛋白質組學技術發展現狀[J]. 生物技術通報, 2017(9).</p> <p>2. Rosenberger G , Koh C C , Guo T , et al. A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS[J]. Scientific Data, 2014, 1:140031.</p> <p>3. 章申燕. mTRAQ/MRM定量技術在AKR家族分析中的應用[D]. 2013.<br /><br />轉載自公眾號：北京安必奇生物科技有限公司<br /><img style="width: 113px; height: 113px;" src="https://img1.dxycdn.com/2019/0902/720/3365979122043343664-14.png" alt="" data-cke-saved-src="https://img1.dxycdn.com/2019/0902/720/3365979122043343664-14.png" />???????</p>