該共識由中國藥師協(xié)會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)細(xì)菌感染與耐藥防治分會(huì)、國家衛(wèi)生健康委臨床抗微生物藥物敏感性折點(diǎn)研究和標(biāo)準(zhǔn)制定專家委員會(huì)共同發(fā)起制定。在臨床檢驗(yàn)、感染、危重癥及體外診斷等領(lǐng)域的專家就mNGS-LDT的流程搭建、性能確認(rèn)、質(zhì)量控制、報(bào)告審核等方面形成共識并提出規(guī)范要求和建議。是國內(nèi)首部針對病原宏基因組高通量測序（mNGS）在LDT規(guī)范化應(yīng)用的專家共識。
全流程的性能確認(rèn)
確認(rèn) mNGS 濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)全流程對病原體的檢測能力是否能夠達(dá)到臨床預(yù)期用途。在全流程性能確認(rèn)中至少應(yīng)包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、分枝桿菌、絲狀真菌、酵母菌、DNA 病毒、RNA病毒、寄生蟲，同時(shí)應(yīng)關(guān)注胞內(nèi)菌和難破壁的病原微生物。
性能確認(rèn)參數(shù)
可參考《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》、《臨床微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏檢測系統(tǒng)的性能驗(yàn)證》、《病原宏基因組高通量測序性能確認(rèn)方案》等，建議實(shí)驗(yàn)室 mNGS 檢測系統(tǒng)應(yīng)對方法符合率、交叉反應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限、抗干擾能力（如針對高人源標(biāo)本）、穩(wěn)定性等性能參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。
樣品盤的制備
樣品盤要包含模擬參考品和已知病原檢測結(jié)果的真實(shí)臨床標(biāo)本。樣品盤的設(shè)置應(yīng)嚴(yán)格遵循臨
床預(yù)期用途所涉及的標(biāo)本類型，所含微生物應(yīng)有代表性，盡可能覆蓋預(yù)期用途中的病原體。標(biāo)準(zhǔn)微生物菌株可以選用ATCC或CMCC菌株等。應(yīng)根據(jù)不同標(biāo)本類型來合理地設(shè)置模擬參考品中的人源細(xì)胞濃度（如支氣管肺泡灌洗液的人源細(xì)胞濃度中位數(shù)為105cells/ml）。模擬參考品中應(yīng)至少包含革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、絲狀真菌、酵母、DNA 病毒、RNA病毒、寄生蟲共7類病原微生物。
1、方法符合率
使用已在國家藥品監(jiān)督管理局備案并批準(zhǔn)上市的商品化實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒、數(shù)字 PCR 試劑盒或臨床金標(biāo)準(zhǔn)（微生物培養(yǎng)鑒定、病理染色等）作為參比方法，必要時(shí)可使用一代測序作為參比。
2、交叉反應(yīng)
選取同屬內(nèi)近源物種，將其分別按照一定濃度比例進(jìn)行混合測序，統(tǒng)計(jì)近源物種的檢出情況、讀長比例、相對豐度 比例與預(yù)期是否一致。
3、精密度
1.批內(nèi)精密度：將上述參考品在同一時(shí)間內(nèi)用相同批次試劑完成 3個(gè)全流程重復(fù)，分析批次內(nèi)結(jié)果重復(fù)性。
2.批間精密度：用不同批次的試劑分別將上述參考品在 3 個(gè)工作日內(nèi)完成各 3 個(gè)全流程重復(fù)，分析批次間重復(fù)性。
3.可接受標(biāo)準(zhǔn)：對陽性標(biāo)本，分析結(jié)果是指通過生信流程得到的檢出病原中包括該參考品中的病原體，則記為正確結(jié)果，否則為錯(cuò)誤結(jié)果。結(jié)果一致的實(shí)驗(yàn)數(shù)占全部實(shí)驗(yàn)數(shù)比例高于95%，判斷為可接受。
4、準(zhǔn)確度
采用參考品（模擬參考品）和真實(shí)臨床標(biāo)本進(jìn)行比對。在真實(shí)臨床標(biāo)本選擇上，應(yīng)綜合病原體分離培養(yǎng)、患者的影像學(xué)檢查結(jié)果、基于宿主反應(yīng)的檢測結(jié)果以及靶向治療后患者的臨床表現(xiàn)等綜合評價(jià)。
1.樣本選擇：全流程檢測不少于 20例標(biāo)本，包括6例陽性參考品（每例模擬混合參考品包含不少于 4 種微生物），14 例臨床標(biāo)本（不少于 10 例培養(yǎng)陽性）。分析檢測結(jié)果與已知參考品的內(nèi)含微生物以及臨床綜合判斷結(jié)果是否一致，對于結(jié)果不一致的使用qPCR 或者送至另一穩(wěn)定運(yùn)行的mNGS實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行差異檢驗(yàn)。
2.可接受標(biāo)準(zhǔn)：20例標(biāo)本中物種準(zhǔn)確性≥90%，則驗(yàn)證通過。對于臨床標(biāo)本，金標(biāo)準(zhǔn)方法和結(jié)合臨床信息綜合判定的病原體在 mNGS 檢測結(jié)果列表之中可判定為符合。
5、檢出限
mNGS的檢出限受宿主細(xì)胞濃度、核酸提取效率、病原體種類等多種因素影響，建議以待測標(biāo)本類型中宿主細(xì)胞的中位數(shù)濃度對病原體檢出限進(jìn)行評估，以95%的重復(fù)均能檢測到某一病原體的最低濃度為檢出限。
1.濃度選擇：使用陽性參考品梯度稀釋至擬定的檢出限濃度，可重復(fù)測定5次或在不同批內(nèi)對該濃度標(biāo)本進(jìn)行 20 次重復(fù)測定（如測定 5 d，每天測定 4 份標(biāo)本）。可根據(jù)情況選用稀釋液或陰性標(biāo)本，該稀釋液不得含有被驗(yàn)證的目標(biāo)病原體。
2.判斷標(biāo)準(zhǔn)：如果是 5 次重復(fù)檢測，必須全部檢出靶核酸；如果是20次檢測，必須檢出至少19次（95%檢出率）靶核酸。
6、穩(wěn)定性
1.實(shí)驗(yàn)過程：將投入5~10倍LoD病原體的臨床模擬標(biāo)本，在4 ℃、-20 ℃冰箱分別保存1、4、7 d，在-80 ℃冰箱分別凍融 1 和 2 次，評估對檢測結(jié)果的影響。
2.可接受標(biāo)準(zhǔn)：所有重復(fù)均檢出目標(biāo)病原體。
7、抗干擾性
在投入 3~5 倍 LoD 病原體的臨床模擬標(biāo)本中分別額外加入更高濃度（比如 106cell/ml、107cell/ml）的宿主細(xì)胞，每份標(biāo)本重復(fù) 2~3 次，以弱陽性參考品無法檢出時(shí)的內(nèi)參 RPM值作為閾值。當(dāng)進(jìn)行臨床報(bào)告解讀時(shí)，若內(nèi)參RPM低于閾值，需警惕假陰性。
為確保mNGS檢測報(bào)告的質(zhì)量，需規(guī)范分析前，分析中，分析后三個(gè)階段的質(zhì)量控制。建議每次測序需要包括陰性和陽性質(zhì)控品。
質(zhì)控品作為患者標(biāo)本的類似物或替代品，完全按照真實(shí)標(biāo)本的檢測流程進(jìn)行操作。不建議用純水或磷酸鹽緩沖液等不含人源細(xì)胞/核酸的標(biāo)本作為陰性對照，陽性質(zhì)控品可以根據(jù)分析 性能確認(rèn)的數(shù)據(jù)，在人源細(xì)胞基質(zhì)（可與陰性對照標(biāo)本濃度保持一致）中投入 3~5倍 LoD（弱陽性）的 不同類型的滅活微生物來制備，不建議使用質(zhì)粒作為陽性質(zhì)控品。
菁良病原分子檢測質(zhì)控品
滅活菌液質(zhì)控品
滅活病毒質(zhì)控品
