熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization）簡稱FISH，是指用已知的熒光素標記的單鏈核酸為探針，按照堿基互補配對的原則，與待檢測材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。隨后在熒光顯微鏡下進行定性、定量或相對定位分析。與傳統的放射性標記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特性高和可以多重染色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。很多公司有探針和成服務，可以直接找公司購買熒光標記的探針，也可以自己通過PCR等方法自行制備。

圖1. 熒光原位雜交示意圖.

下面是我們以Y染色體探針與人外周血細胞中期染色體標本為例，進行熒光原位雜交的實驗操作詳解。

實驗材料：

Y染色體探針（通過缺口平移法制備的biotin標記探針）
人外周血細胞中期染色體標本

實驗試劑：

NaCl、NaOH、檸檬酸鈉、甲酰胺、吐溫20、指甲油，avidin-FITC，anti-avidin，乙醇

儀器、耗材：

培養箱、恒溫水浴鍋、載玻片、蓋玻片、染色缸、封口膜、移液器、暗盒、熒光顯微鏡

相關溶液配制：

1、20×SSC：175.3g NaCl, 88.2g檸檬酸鈉，加水至1000mL（用10mol/L NaOH調pH至7.0）。
2、去離子甲酰胺（DF）：將10g混合床離子交換樹脂加入100mL甲酰胺中。電磁攪拌30min，Whatmanl號濾紙過濾，棕色瓶保存。
3、70%（v/v）甲酰胺/2×SSC：35mL甲酰胺，5mL 20×SSC，10mL水。
4、50%（v/v）甲酰胺/2×SSC：100mL甲酰胺，20mL 20×SSC，80mL水。
5、50%（v/v）硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
6、雜交液（體積分數10% DS，50% DF，2×SSC）：8mL體積分數25%DS， 20mL 20×SSC，混合，然后取上述混合液50mL，與5mL DF混合即成，需現配現用。
7、PI/antifade溶液

• PI原液：先以雙蒸水配置溶液，濃度為100mg/mL，取出1mL，加39mL雙蒸水，使其終濃度為2.5mg /mL。

• Antifade原液：以PBS緩沖液配制該溶液，使其濃度為10mg/mL，用0.5mmol/L的NaHCO₃調pH值為8.0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混勻。

• PI/antifade溶液：PI與antifade原液按體積比1：9比例充分混勻，-20℃保存備用。

8、封閉液I：體積分數5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，dd H2O 1mL, Tween 20 5mL，混合。
9、封閉液II：體積分數5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250mL, dd H2O 750mL, Tween 20 5mL，混合。
10、洗脫液：100mL 20×SSC，加水至500mL，再加Tween20 500 mL。

實驗步驟：

1、探針變性
將探針在75℃恒溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

2、標本變性
（1）將制備好的染色體玻片置于50℃培養箱中，烤片2～3h。
（2）取出玻片標本，浸于70～75℃、體積分數70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。
（3）按順序將標本經體積分數70%、90%和100%的冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。

3、雜交
將已變性的DNA探針10μL滴于已變性脫水的玻片標本上，蓋上蓋玻片，用Parafilm（封口膜）小心封片，置于潮濕暗盒中，37℃培養箱中雜交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態，此過程在濕盒中進行。

4、洗脫
（1）雜交次日，將標本從37℃培養箱中取出，輕輕揭掉蓋玻片。
（2）將已雜交的玻片標本置于42～50℃的體積分數50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。
（3）在42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。
（4）室溫下，將玻片標本置于2×SSC中輕洗一下。
此步驟有助于除去非特異性結合的探針，從而降低背景。

5、雜交信號的放大
（1）加150μL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。
（2）去掉保鮮膜，再加150μL avidin-FITC于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續溫育40min。請注意，后續的步驟都需要避光處理！！
（3）取出標本，將其放入42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。
（4）加150μL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。
（5）去掉保鮮膜，加150μL anti-avidin于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。
（6）取出標本，將其放入42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。
（7）重復步驟（1）、（2）、（3），再于室溫下2×SSC中清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）將200μL PI/antifade染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

6、封片
可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產生自封閉作用），為防止蓋玻片與載玻片之間的溶液揮發，可使用指甲油將蓋玻片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持數月之久。

7、熒光顯微鏡鏡檢
先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發光源，經FITC標記的探針所在位置發出綠色熒光。

附：探針的生物素標記

本實驗采用缺口平移法，以biotin-14-dATP標記探針。標記好的探針可以在-20℃下長期保存。

1、10X dNTP：500 mmol/L Tris · HCl (pH 7.8), 50 mmol/L MgCl₂, 100 mmol/L β-硫基乙醇, 100 mg/ml去除核酸酶的牛血清白蛋白, 0.2 mmol/L dCTP, 0.2 mmol/L dGTP, 0.2 mmol/L dTTP, 0.1 mmol/L dATP, 0.1 mmol/L biotin-14-dATP。

2、10X Enzyme Mix： 0.5 units/mL DNA聚合酶I, 0.075 units/mL Dnase I, 50 mmol/L Tris · HCl(pH 7.5), 5 mmol/L醋酸鎂, 1 mmol/L β-硫基乙醇, 0.1 mmol/L PMSF, 50%（v/v）甘油, 100 mg/mL牛血清白蛋白。

3、總反映體積50 mL：DNA 1 mg, 10X dNTP 5 mL, 10X Enzyme Mix 5 mL。

4、將上述混合液于16℃作用1 h。用8.0 g/L瓊脂糖/TBE緩沖液凝膠電檢測標記產物。以DN**段長約300～500 bp為宜。如片段較大，則應加適量Dnase I繼續酶切，直至DN**段長度適中后，加5mL終止緩沖液（300mmol/L EDTA）終止反應。用乙醇沉淀的方法將探針與非摻入的核苷酸分開。