FFPE（Formalin-fixed paraffin-embedding）樣本是醫學領域常見的生物材料。此類樣本已經被廣泛應用于高通量測序、原位雜交、免疫組織化學等研究領域。目前，全球約有數億FFPE組織樣本,這些組織樣本已經是疾病診斷和科學研究的最為寶貴的的生物學資源之一。
隨著基因組學檢測技術的快速發展，尤其新一代測序技術（NGS）的飛速發展，在細胞分子水平提供了前/所未有的檢測能力，研究人員可以使用這一技術手段對FFPE樣本進行研究，尋找與疾病相關的基因突變。
FFPE樣本的制備
1.樣本的采集：組織固定前的操作時間應當越短越好，以避免基因表達改變、組織自溶等變化
2.福爾馬林固定：組織的固定使用的是福/爾馬林溶液。將組織放到一定濃度的福/爾馬林溶液中，使核酸之間、蛋白質之間、以及核酸和蛋白質之間產生一定程度的交聯,固定時間越長，交聯程度越大
3.石蠟包埋：福爾馬林固定之后，需要用石蠟將組織進行包埋，其包括四個主要步驟：脫水，透明，浸蠟和包埋。在固定和包埋之后，FFPE樣品最好應在最佳溫度下保存，這樣可減緩核酸和蛋白的降解
從FFPE樣品中提取出的核酸和蛋白的質量取決于固定和包埋之前、期間和之后如何處理樣品，樣本如果未處理好，會造成核酸嚴重片段化，我們需要對處理后的樣本進行質控，以便后續開展核酸提取和測序等下游應用。
FFPE樣本核酸提取
FFPE樣本的DNA品質會顯著影響后續熒光定量或者二代測序文庫的構建成功率和測序數據指標。所以從FFPE樣本中提取出高質量的DNA，尤為重要。
通常，FFPE樣本核酸提取實驗包括以下流程：樣本切片、脫蠟和水化、蛋白酶K組織消化、基因組DNA的純化、核酸提取。
樣本切片：石蠟樣本在提取前需要進行切片處理，一般需要5-6個切片，一片鏡檢確定腫瘤細胞含量，其他進行后續提取處理，切片的薄厚程度對后續觀察和提取會有一定影響
脫蠟和水化：因為FFPE樣本的特殊性，石蠟會阻礙消化液對組織的滲透，從而抑制蛋白酶K和組織內蛋白的接觸，影響到組織消化和核酸的釋放。為消除石蠟對DNA提取和PCR擴增的不良影響，必須組織進行徹底的脫蠟
蛋白酶K組織消化：為了將DNA與結合的蛋白質分離，FFPE樣本需經受高溫和蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白質組分以及樣品中可能存在的任何核酸酶，這個步驟還可防止DNA發生降解。注意要把握好消化時間，可以根據組織類型、組織大小進行調節，使DNA充分釋放
基因組DNA純化：FFPE樣本中核酸和蛋白質是緊密交聯在一起的，進行組織消化后樣品已經變成水化狀態，此時需要進行震蕩解交聯，釋放DNA用于后續純化。如果可能的話，因交聯而引起的化學修飾也應當逆轉，因為化學修飾的DNA不能在純化過程中高效回收，而且在PCR或其他酶學分析中是一個不佳的底物，在斷裂交聯和逆轉化學修飾時必須小心，因劇烈的反應條件可能導致DNA的進一步片段化
核酸提取：根據不同的研究目的選取相應的方法提取DNA，常用的有酚氯/仿抽提法、柱膜法、磁珠法等等
由于FFPE樣品很珍貴，所以只有有限的材料可用于下游分析。菁良FFPE標準品能夠助于FFPE提取流程性能確認和試劑盒提取效率性能驗證，確保能夠高效地從FFPE樣品中回收可分析的生物分子。
FFPE樣本的二代建庫注意細節
對FFPE樣本提取出來的DNA進行質控
在建庫前需要先對DNA進行質檢，主要檢測DNA的總量（濃度）、完整性以及純度。DNA的建庫起始投入量不足、DNA有降解、存在雜質污染等這些因素會影響建庫的成功率以及后續測序數據的表現。所以，濃度測定一定要準確，目的是保證建庫投入量的準確性。電泳檢測DNA如果有降解的話，需要根據降解程度來適當調整后續DNA的打斷時間。如果存在蛋白質、RNA等雜質污染的話，需要用蛋白酶K、RNA酶等進行消化、純化處理。目的都是為了在建庫前了解DNA的質量，一方面可以提前采取措施提高建庫的成功率，另一方面當后續實驗或者測序數據指標出現問題時可以更好的追溯原因。
打斷前損傷修復
FFPE樣本在制備和保存過程中會使得基因組DNA發生一定程度的損傷，比如缺口、胞嘧啶脫氨基為尿嘧啶等，為了提高文庫質量，建議將DNA先用特定的酶混合物進行修復，然后再進行打斷
打斷時間
FFPE樣本由于保存環境以及時間的不同，提取出來的DNA會發生不同程度的降解，所以在打斷的時候，打斷循環數（也就是打斷時間）需要根據DNA的降解程度進行調整，使打斷后片段峰值盡量集中在預期的范圍之內
由于樣本降解等因素可能會造成建庫困難、建庫產量低、文庫測序質量差等問題，影響后續突變檢出率，菁良FFPE標準品還可助于FFPE建庫效率質控，解決“假陰性”問題
FFPE樣本檢測中諸多挑戰
雖然測試平臺經常會校準，使用的樣本也是經過校準的，但是實際操作中的樣本經常會面臨很多意想不到的挑戰。FFPE 樣本出現的問題是固定過程和存儲條件均會造成大量的DNA損傷，從其中提取出來的DNA質量一般都比較差，主要體現在以下方面：
- DNA總量少
- 在FFPE樣本的制備過程中，組織經福爾馬林固定、石蠟包埋時很容易引起DNA的降解，長期的儲存也會導致核酸進一步降解
- 在將FFPE樣本中的組織進行脫蠟分離時使用的脫蠟試劑，也會導致核酸再次降解
- 組織消化不徹底會嚴重影響DNA的得率
- 存在C>T/G>A等堿基替換造成檢測結果的假陽性
- 脫蠟試劑殘留會干擾后續建庫實驗
DNA損傷的變異數量和類型，如果忽略，可能會對最終結果產生負面影響，這對下游應用比如測序的影響是巨大的：從簡單測序文庫構建的失敗到虛假文庫的產生，最終導致結果的錯誤。
菁良解決方案
高通量測序技術的不斷進步降低了可靠檢測測序突變的頻度閾值, 如何從FFPE樣本中獲得高品質的適合NGS分析的DNA變得異常關鍵，而在測序項目開始時正確評估每個樣本的質量也至關重要。
針對FFPE樣本在研究中面臨的難點，菁良提供了系列模擬臨床樣本的FFPE標準品，主要以供：
- FFPE樣本質量質控
- FFPE提取流程性能確認
- FFPE提取試劑盒提取效率性能驗證
- FFPE建庫效率質控
- FFPE PCR/NGS檢測結果驗證
FFPE標準品
?FFPE蠟塊或切片
?樣本來源于人類細胞系，最/大程度模擬患者FFPE樣本
?數字PCR平臺驗證變異位點
?產品包含DNA及RNA兩種形式
?包括ALK,ROS1,RET,NTRK等融合基因
?突變來源于非小細胞肺癌NCCN指南推薦的基因
腫瘤融合FFPE標準品
?兼容主流監測平臺：PCR,NGS
?覆蓋常見熱門伴隨診斷融合基因：ALK，RET，ROS1，NTRK1，NTRK3等
?含DNA及RNA層面的融合
?可用于基因融合檢測Panel的性能驗證、日常質控、室間質評、DNA及RNA提取效率的驗證等
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