隨著個體化醫學的發展和"精準醫學"概念的提出，腫瘤藥物治療發展迅速，臨床研究逐漸發現并證實更多與藥物治療療效預測相關的基因突變。傳統的基因突變檢測方法如Sanger測序、焦磷酸測序和實時熒光PCR等僅能對單個基因，或者單個基因的部分外顯子突變進行檢測，采用上述傳統基因突變檢測方法同時檢測多個基因，一則需要的樣本量大，其次需要更長的檢測時間和更大的工作量。高通量測序（HTS）即下一代測序（NGS），能夠同時對上百萬甚至數十億個DN**段進行測序，可實現在較低的成本下，一次對多至上百個腫瘤相關基因、全外顯子以及全基因組進行檢測，而且需要的樣本量并不增加。因其在通量、成本和效率方面的優勢，NGS在實體腫瘤體細胞基因突變中展現了其廣闊的應用前景。

NGS檢測流程復雜，對實驗室環境條件、人員能力及質量管理要求高。實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測中，低頻突變、腫瘤異質性、樣本種類多樣、樣本質量差別較大等均給實驗室檢測帶來了挑戰，因此其在方法建立、分析前、中、后質量控制等方面均有其特殊之處。

實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測實驗室建設的總體要求

實驗室分區

實體腫瘤體細胞突變檢測通常分析敏感性較高，臨床實驗室應尤其注意合理分區，以防止污染。雜交捕獲法NGS建議的分區包括試劑準備區、樣本制備前區、樣本制備區、打斷區、電泳區、文庫制備區、擴增一區、雜交捕獲區、擴增二區和測序區。但是不同檢測流程，分區設置有所不同，臨床實驗室應根據"通用共識"的"32字原則"來考慮實驗室分區設置。若實驗室同時檢測血漿和組織或細胞學兩類樣本，則需設置不同的樣本制備區及其后續的文庫制備過程中的相應區域。

實驗室人員及能力要求

NGS實驗室負責人或技術負責人應有全面的NGS及其實驗室質量管理知識。采用組織樣本進行檢測的實驗室，"濕實驗"團隊成員應包括病理醫（技）師人員。生物信息學分析團隊中應有具備臨床腫瘤學和臨床分子檢測基本知識的人員。簽發報告人員應具備醫學分子生物學和臨床腫瘤學知識背景，熟練使用相關數據庫，掌握本領域的指南，了解相關研究的最/新進展。對于疑難病例或必要時，可由不同專業的專家組成的分子腫瘤專家組給出個體化治療方案。使用LDTs的實驗室，應配備"濕實驗"和"干實驗"研發人員，其應具有正確設定腫瘤體細胞突變NGS檢測臨床預期用途、建立檢測系統（含試劑配制和生物信息分析流程搭建等）及其使用SOPs以及完成LDTs性能確認的能力。

腫瘤基因突變NGS檢測流程的建立與質量保證

實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測的臨床預期用途為通過體細胞基因突變檢測選擇可能在靶向或免疫治療藥物使用中受益的患者以及耐藥監測。臨床實驗室應在預期用途中包括但不限于適用人群、樣本類型、檢測基因及其突變位點或突變類型和檢測的臨床意義等。

在NGS方法學建立和優化階段，實驗室需根據臨床預期用途，選擇具有臨床意義的待測基因位點；優化核酸提取方法，所提取核酸的質量應滿足檢測要求；建立和優化文庫制備方法；對測序平臺進行性能確認，建立測序平臺檢測不同突變類型的性能指標；搭建和優化生物信息學分析流程，確定測序深度和陽性判斷值，并對生物信息學分析流程進行性能確認。

1. 待測基因位點的選擇

需根據檢測目的，依據醫學科學證據選擇待測基因位點。檢測panel的大小決定了測序成本、實驗室檢測工作量以及分析和臨床解釋的復雜性，實驗室應合理選擇基因和panel大小。

2. 核酸提取的建立和優化

實驗室需根據待檢樣本類型選擇核酸提取試劑，不同樣本類型對核酸提取試劑要求不同，實驗室可使用商業化的提取試劑盒、設備或已經過確認的自建核酸提取方法。使用前，應對擬采用的試劑或設備進行評估，評估是否適用擬檢測的癌種和樣本類型。實驗室需確認核酸提取的重復性、提取效率、提取純度及不同大小核酸片段提取的偏好性（必要時）等方面。

3. 文庫制備的建立和優化

實驗室需確認文庫制備流程可以產生滿足檢測要求的文庫（文庫濃度、文庫片段大小等），評估交叉污染發生率，必要時通過特異雙端標簽建庫策略以及合適的生物信息學分析流程降低污染。

4. 測序平臺的性能確認

實驗室應優先選擇NMPA批準的測序平臺，并根據所選定的基因panel，并綜合考慮測序通量、測序數據準確度、可支持讀長、運行時間、測序成本等選擇測序平臺型號。對已知不同突變類型的樣本進行檢測，建立測序平臺檢測不同突變類型的性能指標（如精密度、準確度），并明確所用測序平臺是否滿足臨床預期用途。

5. 生物信息學分析流程的搭建與性能確認

在生物信息學分析流程搭建和優化過程中，實驗室應確定測序深度和陽性判斷值（cut-off）。測序深度和陽性判斷值密切相關，即適宜的測序深度需在已知陽性判斷值的前提下方可確定；而合理的陽性判斷值也需在一定的測序深度條件下明確。

實驗室應根據所檢測的突變類型，選擇合適的算法和軟件，提高對腫瘤基因突變檢測的敏感性。不同軟件或算法識別某種變異類型的能力有所不同，應采用多種算法，以提高不同突變類型的檢出準確率。另外還應建立完善包括數據質控與過濾、數據比對、變異識別和變異注釋在內的生物信息學數據分析流程、軟件及數據庫。

性能驗證或性能確認

使用NMPA批準的NGS試劑進行檢測前應進行分析性能驗證；LDTs試劑應根據臨床預期用途進行試劑方法的設計和優化，至少要對體細胞基因突變的識別策略、樣本前處理、核酸提取、文庫制備、靶向捕獲、高通量測序平臺、生物信息學分析、測序深度和陽性判斷值等環節進行確認。

在完成試劑方法的設計和優化后，實驗室應對LDTs檢測的全流程進行整體的性能確認。分析性能確認應至少證明NGS對各種不同突變類型的檢測能力，證明對重要常見基因的檢測能力。

如果臨床實驗室可接收多個樣本類型，那么對每種樣本類型均需分別進行性能確認。沒有足夠的臨床樣本，可以使用模擬樣本來代替。

分析性能確認包括但不限于精密度、準確度、分析敏感性、分析特異性和可報告范圍等。在確認分析性能特征可以滿足臨床預期用途后，最終完成建立"濕實驗"試劑配制和"干實驗"生物信息學分析流程SOPs。

對預期用途為伴隨診斷的NGS檢測需進行臨床性能確認。性能評價應包含檢測范圍內樣本類型和突變類型。通過性能評價，建立性能參數，明確檢測的局限性。若實驗室流程發生改動，需根據對檢測的影響進行全面或部分性能確認。

實驗室檢測SOPs的建立

分析前

實驗室應制定每一種類型樣本采集、運送、接收和保存的SOPs，明確樣本接收和拒收標準，建立合適的樣本運輸和保存要求。適用于腫瘤基因突變NGS檢測的樣本主要包括FFPE、血漿、新鮮組織、胸腹水等。

采用FFPE、胸腹水細胞沉淀或新鮮組織進行NGS檢測前，需先評估樣本質量和腫瘤細胞的含量。為避免交叉污染，切片制備過程中，應使用一次性耗材。血漿樣本采集、運送、接收和保存的核心是避免外周血有核細胞裂解釋放基因組DNA稀釋游離DNA或游離DNA降解。

分析前記錄的關鍵點為樣本接收、拒收和預處理的記錄。當樣本質量未達到SOPs要求時，可進行讓步檢測，但應建立對應的異常情況處理程序。

分析中

實驗室應根據性能確認或性能驗證的結果，建立分析中檢測的標準操作程序。各環節的質量標準是標準操作程序的重要組成，包括核酸提取后，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫制備的DNA上樣量和文庫制備后進行雜交捕獲上樣量的要求，最低測序深度、平均測序深度、覆蓋均一性、GC含量、堿基識別質量值、比對質量值和在靶率等要求，這些要求也同時是分析中實驗記錄的關鍵點。若某一關鍵環節的檢測質量控制參數不符合要求，則實驗室應根據所建立的異常情況的處理程序進行處理。

此外，實驗室應根據可檢測的樣本類型、突變類型、檢測下限等設置合適的包括所檢測的所有突變類型的弱陽性、陰性和無模板對照（如水樣本）質控品，且與待檢樣本同批檢測。

定期參加EQA/PT或進行實驗室間比對等。出現失控，應分析失控原因，并采取相應的糾正措施和預防措施。

分析后

實驗室應對體細胞基因突變藥物療效預測的臨床意義進行解釋。實驗室應制定結果解釋的SOPs，并遵循準確、及時和充分的原則。在需要的情況下，臨床實驗室應給出進一步檢測的建議。由于樣本質量或其他質量要求未達到，但樣本有限的情況進行的讓步檢測，也應在報告中進行說明。與腫瘤無關的意外發現因難以解釋，建議不在檢測報告中進行呈現。在對如結直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等具有遺傳傾向的腫瘤進行NGS檢測時，需結合家族史，考慮是否為遺傳性腫瘤，并建立遺傳咨詢流程。

NGS技術在腫瘤的精準診療中具有重要作用，實驗室應加強質量管理，保證NGS檢測結果的準確性。本共識對實體腫瘤體細胞基因突變NGS檢測中的臨床預期用途確定、方法建立與優化、LDTs性能確認、分析前中后的質量保證關鍵環節進行了闡述。

目前，實體腫瘤基因突變NGS突變檢測主要用于腫瘤靶向用藥指導及其耐藥監測和免疫治療療效評估。隨著發展，新的生物標志物將不斷出現，新的NGS測序技術不斷進入臨床檢測，預期用途還會進一步擴大。

菁良解決方案

菁良多種標準品/質控品能夠應用于檢測的日常質控、EQA/PT以及LDT性能確認，對于整個NGS檢測流程，從核酸提取→文庫制備→測序→數據/結果分析，可以全流程監控檢測分析，并驗證檢測結果的精確性和特異性。

泛腫瘤800gDNA標準品

? 樣本來源于人類細胞系
? 覆蓋多種癌癥有關變異位點
? 驗證位點多（大于320個基因、720個突變）
? 變異類型全
? 變異位點多為已知數據庫位點
? 突變位點頻率范圍寬(1-100%)
? ddPCR驗證位點突變頻率呈梯度(1-7%)
? 變異位點分布范圍廣
? 多種平臺驗證變異位點
? 全外顯子測序采用業內公認度極高的捕獲芯片及測序平臺
? 涵蓋位點包含多個國際知名腫瘤檢測Panel

FFPE標準品

? FFPE蠟塊或切片
? 樣本來源于人類細胞系，最/大程度模擬患者FFPE樣本
? 數字PCR平臺驗證變異位點
? 產品包含DNA及RNA兩種形式
? 包括ALK,ROS1,RET,NTRK等融合基因
? 突變來源于非小細胞肺癌NCCN指南推薦的基因

肺癌ctDNA標準品套裝

? 樣本來源于人類細胞系
? 變異位點頻率經過數字PCR平臺驗證
? 套裝包含三管產品，對應三個AF梯度：0，0.1%，1%
? 涵蓋8個非小細胞肺癌熱門基因突變位點
? 標準品平均片段長度為160bp，最/大程度模擬循環腫瘤DN**段分布

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參考資料：北京市臨床檢驗中心, 北京醫學會檢驗醫學分會, 首都醫科大學臨床檢驗診斷學系, 等. 高通量測序技術臨床規范化應用北京專家共識（第一版腫瘤部分） [J] . 中華醫學雜志,2020,100 (09): 648-659. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.09.003