隨著個(gè)體化醫(yī)學(xué)的發(fā)展和"精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)"概念的提出，腫瘤藥物治療發(fā)展迅速，臨床研究逐漸發(fā)現(xiàn)并證實(shí)更多與藥物治療療效預(yù)測(cè)相關(guān)的基因突變。傳統(tǒng)的基因突變檢測(cè)方法如Sanger測(cè)序、焦磷酸測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光PCR等僅能對(duì)單個(gè)基因，或者單個(gè)基因的部分外顯子突變進(jìn)行檢測(cè)，采用上述傳統(tǒng)基因突變檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，一則需要的樣本量大，其次需要更長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間和更大的工作量。高通量測(cè)序（HTS）即下一代測(cè)序（NGS），能夠同時(shí)對(duì)上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DN**段進(jìn)行測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)在較低的成本下，一次對(duì)多至上百個(gè)腫瘤相關(guān)基因、全外顯子以及全基因組進(jìn)行檢測(cè)，而且需要的樣本量并不增加。因其在通量、成本和效率方面的優(yōu)勢(shì)，NGS在實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變中展現(xiàn)了其廣闊的應(yīng)用前景。
NGS檢測(cè)流程復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件、人員能力及質(zhì)量管理要求高。實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)中，低頻突變、腫瘤異質(zhì)性、樣本種類多樣、樣本質(zhì)量差別較大等均給實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)帶來了挑戰(zhàn)，因此其在方法建立、分析前、中、后質(zhì)量控制等方面均有其特殊之處。
實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的總體要求
實(shí)驗(yàn)室分區(qū)
實(shí)體腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)通常分析敏感性較高，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)尤其注意合理分區(qū)，以防止污染。雜交捕獲法NGS建議的分區(qū)包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備前區(qū)、樣本制備區(qū)、打斷區(qū)、電泳區(qū)、文庫制備區(qū)、擴(kuò)增一區(qū)、雜交捕獲區(qū)、擴(kuò)增二區(qū)和測(cè)序區(qū)。但是不同檢測(cè)流程，分區(qū)設(shè)置有所不同，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)"通用共識(shí)"的"32字原則"來考慮實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置。若實(shí)驗(yàn)室同時(shí)檢測(cè)血漿和組織或細(xì)胞學(xué)兩類樣本，則需設(shè)置不同的樣本制備區(qū)及其后續(xù)的文庫制備過程中的相應(yīng)區(qū)域。
實(shí)驗(yàn)室人員及能力要求
NGS實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)有全面的NGS及其實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理知識(shí)。采用組織樣本進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，"濕實(shí)驗(yàn)"團(tuán)隊(duì)成員應(yīng)包括病理醫(yī)（技）師人員。生物信息學(xué)分析團(tuán)隊(duì)中應(yīng)有具備臨床腫瘤學(xué)和臨床分子檢測(cè)基本知識(shí)的人員。簽發(fā)報(bào)告人員應(yīng)具備醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)知識(shí)背景，熟練使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫，掌握本領(lǐng)域的指南，了解相關(guān)研究的最/新進(jìn)展。對(duì)于疑難病例或必要時(shí)，可由不同專業(yè)的專家組成的分子腫瘤專家組給出個(gè)體化治療方案。使用LDTs的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)配備"濕實(shí)驗(yàn)"和"干實(shí)驗(yàn)"研發(fā)人員，其應(yīng)具有正確設(shè)定腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測(cè)臨床預(yù)期用途、建立檢測(cè)系統(tǒng)（含試劑配制和生物信息分析流程搭建等）及其使用SOPs以及完成LDTs性能確認(rèn)的能力。
腫瘤基因突變NGS檢測(cè)流程的建立與質(zhì)量保證
實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)的臨床預(yù)期用途為通過體細(xì)胞基因突變檢測(cè)選擇可能在靶向或免疫治療藥物使用中受益的患者以及耐藥監(jiān)測(cè)。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在預(yù)期用途中包括但不限于適用人群、樣本類型、檢測(cè)基因及其突變位點(diǎn)或突變類型和檢測(cè)的臨床意義等。
在NGS方法學(xué)建立和優(yōu)化階段，實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)臨床預(yù)期用途，選擇具有臨床意義的待測(cè)基因位點(diǎn)；優(yōu)化核酸提取方法，所提取核酸的質(zhì)量應(yīng)滿足檢測(cè)要求；建立和優(yōu)化文庫制備方法；對(duì)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行性能確認(rèn)，建立測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)不同突變類型的性能指標(biāo)；搭建和優(yōu)化生物信息學(xué)分析流程，確定測(cè)序深度和陽性判斷值，并對(duì)生物信息學(xué)分析流程進(jìn)行性能確認(rèn)。
1. 待測(cè)基因位點(diǎn)的選擇
需根據(jù)檢測(cè)目的，依據(jù)醫(yī)學(xué)科學(xué)證據(jù)選擇待測(cè)基因位點(diǎn)。檢測(cè)panel的大小決定了測(cè)序成本、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作量以及分析和臨床解釋的復(fù)雜性，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)合理選擇基因和panel大小。
2. 核酸提取的建立和優(yōu)化
實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)待檢樣本類型選擇核酸提取試劑，不同樣本類型對(duì)核酸提取試劑要求不同，實(shí)驗(yàn)室可使用商業(yè)化的提取試劑盒、設(shè)備或已經(jīng)過確認(rèn)的自建核酸提取方法。使用前，應(yīng)對(duì)擬采用的試劑或設(shè)備進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估是否適用擬檢測(cè)的癌種和樣本類型。實(shí)驗(yàn)室需確認(rèn)核酸提取的重復(fù)性、提取效率、提取純度及不同大小核酸片段提取的偏好性（必要時(shí)）等方面。
3. 文庫制備的建立和優(yōu)化
實(shí)驗(yàn)室需確認(rèn)文庫制備流程可以產(chǎn)生滿足檢測(cè)要求的文庫（文庫濃度、文庫片段大小等），評(píng)估交叉污染發(fā)生率，必要時(shí)通過特異雙端標(biāo)簽建庫策略以及合適的生物信息學(xué)分析流程降低污染。
4. 測(cè)序平臺(tái)的性能確認(rèn)
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先選擇NMPA批準(zhǔn)的測(cè)序平臺(tái)，并根據(jù)所選定的基因panel，并綜合考慮測(cè)序通量、測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度、可支持讀長(zhǎng)、運(yùn)行時(shí)間、測(cè)序成本等選擇測(cè)序平臺(tái)型號(hào)。對(duì)已知不同突變類型的樣本進(jìn)行檢測(cè)，建立測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)不同突變類型的性能指標(biāo)（如精密度、準(zhǔn)確度），并明確所用測(cè)序平臺(tái)是否滿足臨床預(yù)期用途。
5. 生物信息學(xué)分析流程的搭建與性能確認(rèn)
在生物信息學(xué)分析流程搭建和優(yōu)化過程中，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確定測(cè)序深度和陽性判斷值（cut-off）。測(cè)序深度和陽性判斷值密切相關(guān)，即適宜的測(cè)序深度需在已知陽性判斷值的前提下方可確定；而合理的陽性判斷值也需在一定的測(cè)序深度條件下明確。
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所檢測(cè)的突變類型，選擇合適的算法和軟件，提高對(duì)腫瘤基因突變檢測(cè)的敏感性。不同軟件或算法識(shí)別某種變異類型的能力有所不同，應(yīng)采用多種算法，以提高不同突變類型的檢出準(zhǔn)確率。另外還應(yīng)建立完善包括數(shù)據(jù)質(zhì)控與過濾、數(shù)據(jù)比對(duì)、變異識(shí)別和變異注釋在內(nèi)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析流程、軟件及數(shù)據(jù)庫。
性能驗(yàn)證或性能確認(rèn)
使用NMPA批準(zhǔn)的NGS試劑進(jìn)行檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行分析性能驗(yàn)證；LDTs試劑應(yīng)根據(jù)臨床預(yù)期用途進(jìn)行試劑方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，至少要對(duì)體細(xì)胞基因突變的識(shí)別策略、樣本前處理、核酸提取、文庫制備、靶向捕獲、高通量測(cè)序平臺(tái)、生物信息學(xué)分析、測(cè)序深度和陽性判斷值等環(huán)節(jié)進(jìn)行確認(rèn)。
在完成試劑方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)LDTs檢測(cè)的全流程進(jìn)行整體的性能確認(rèn)。分析性能確認(rèn)應(yīng)至少證明NGS對(duì)各種不同突變類型的檢測(cè)能力，證明對(duì)重要常見基因的檢測(cè)能力。
如果臨床實(shí)驗(yàn)室可接收多個(gè)樣本類型，那么對(duì)每種樣本類型均需分別進(jìn)行性能確認(rèn)。沒有足夠的臨床樣本，可以使用模擬樣本來代替。
分析性能確認(rèn)包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性和可報(bào)告范圍等。在確認(rèn)分析性能特征可以滿足臨床預(yù)期用途后，最終完成建立"濕實(shí)驗(yàn)"試劑配制和"干實(shí)驗(yàn)"生物信息學(xué)分析流程SOPs。
對(duì)預(yù)期用途為伴隨診斷的NGS檢測(cè)需進(jìn)行臨床性能確認(rèn)。性能評(píng)價(jià)應(yīng)包含檢測(cè)范圍內(nèi)樣本類型和突變類型。通過性能評(píng)價(jià)，建立性能參數(shù)，明確檢測(cè)的局限性。若實(shí)驗(yàn)室流程發(fā)生改動(dòng)，需根據(jù)對(duì)檢測(cè)的影響進(jìn)行全面或部分性能確認(rèn)。
實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SOPs的建立
分析前
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定每一種類型樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的SOPs，明確樣本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，建立合適的樣本運(yùn)輸和保存要求。適用于腫瘤基因突變NGS檢測(cè)的樣本主要包括FFPE、血漿、新鮮組織、胸腹水等。
采用FFPE、胸腹水細(xì)胞沉淀或新鮮組織進(jìn)行NGS檢測(cè)前，需先評(píng)估樣本質(zhì)量和腫瘤細(xì)胞的含量。為避免交叉污染，切片制備過程中，應(yīng)使用一次性耗材。血漿樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的核心是避免外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA稀釋游離DNA或游離DNA降解。
分析前記錄的關(guān)鍵點(diǎn)為樣本接收、拒收和預(yù)處理的記錄。當(dāng)樣本質(zhì)量未達(dá)到SOPs要求時(shí)，可進(jìn)行讓步檢測(cè)，但應(yīng)建立對(duì)應(yīng)的異常情況處理程序。
分析中
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)性能確認(rèn)或性能驗(yàn)證的結(jié)果，建立分析中檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。各環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)操作程序的重要組成，包括核酸提取后，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫制備的DNA上樣量和文庫制備后進(jìn)行雜交捕獲上樣量的要求，最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度、覆蓋均一性、GC含量、堿基識(shí)別質(zhì)量值、比對(duì)質(zhì)量值和在靶率等要求，這些要求也同時(shí)是分析中實(shí)驗(yàn)記錄的關(guān)鍵點(diǎn)。若某一關(guān)鍵環(huán)節(jié)的檢測(cè)質(zhì)量控制參數(shù)不符合要求，則實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所建立的異常情況的處理程序進(jìn)行處理。
此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)可檢測(cè)的樣本類型、突變類型、檢測(cè)下限等設(shè)置合適的包括所檢測(cè)的所有突變類型的弱陽性、陰性和無模板對(duì)照（如水樣本）質(zhì)控品，且與待檢樣本同批檢測(cè)。
定期參加EQA/PT或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)等。出現(xiàn)失控，應(yīng)分析失控原因，并采取相應(yīng)的糾正措施和預(yù)防措施。
分析后
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)體細(xì)胞基因突變藥物療效預(yù)測(cè)的臨床意義進(jìn)行解釋。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定結(jié)果解釋的SOPs，并遵循準(zhǔn)確、及時(shí)和充分的原則。在需要的情況下，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)給出進(jìn)一步檢測(cè)的建議。由于樣本質(zhì)量或其他質(zhì)量要求未達(dá)到，但樣本有限的情況進(jìn)行的讓步檢測(cè)，也應(yīng)在報(bào)告中進(jìn)行說明。與腫瘤無關(guān)的意外發(fā)現(xiàn)因難以解釋，建議不在檢測(cè)報(bào)告中進(jìn)行呈現(xiàn)。在對(duì)如結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等具有遺傳傾向的腫瘤進(jìn)行NGS檢測(cè)時(shí)，需結(jié)合家族史，考慮是否為遺傳性腫瘤，并建立遺傳咨詢流程。
NGS技術(shù)在腫瘤的精準(zhǔn)診療中具有重要作用，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量管理，保證NGS檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本共識(shí)對(duì)實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)中的臨床預(yù)期用途確定、方法建立與優(yōu)化、LDTs性能確認(rèn)、分析前中后的質(zhì)量保證關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了闡述。
目前，實(shí)體腫瘤基因突變NGS突變檢測(cè)主要用于腫瘤靶向用藥指導(dǎo)及其耐藥監(jiān)測(cè)和免疫治療療效評(píng)估。隨著發(fā)展，新的生物標(biāo)志物將不斷出現(xiàn)，新的NGS測(cè)序技術(shù)不斷進(jìn)入臨床檢測(cè)，預(yù)期用途還會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。
菁良解決方案
菁良多種標(biāo)準(zhǔn)品/質(zhì)控品能夠應(yīng)用于檢測(cè)的日常質(zhì)控、EQA/PT以及LDT性能確認(rèn)，對(duì)于整個(gè)NGS檢測(cè)流程，從核酸提取→文庫制備→測(cè)序→數(shù)據(jù)/結(jié)果分析，可以全流程監(jiān)控檢測(cè)分析，并驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的精確性和特異性。
泛腫瘤800gDNA標(biāo)準(zhǔn)品
? 樣本來源于人類細(xì)胞系
? 覆蓋多種癌癥有關(guān)變異位點(diǎn)
? 驗(yàn)證位點(diǎn)多（大于320個(gè)基因、720個(gè)突變）
? 變異類型全
? 變異位點(diǎn)多為已知數(shù)據(jù)庫位點(diǎn)
? 突變位點(diǎn)頻率范圍寬(1-100%)
? ddPCR驗(yàn)證位點(diǎn)突變頻率呈梯度(1-7%)
? 變異位點(diǎn)分布范圍廣
? 多種平臺(tái)驗(yàn)證變異位點(diǎn)
? 全外顯子測(cè)序采用業(yè)內(nèi)公認(rèn)度極高的捕獲芯片及測(cè)序平臺(tái)
? 涵蓋位點(diǎn)包含多個(gè)國(guó)際知名腫瘤檢測(cè)Panel
FFPE標(biāo)準(zhǔn)品
? FFPE蠟塊或切片
? 樣本來源于人類細(xì)胞系，最/大程度模擬患者FFPE樣本
? 數(shù)字PCR平臺(tái)驗(yàn)證變異位點(diǎn)
? 產(chǎn)品包含DNA及RNA兩種形式
? 包括ALK,ROS1,RET,NTRK等融合基因
? 突變來源于非小細(xì)胞肺癌NCCN指南推薦的基因
肺癌ctDNA標(biāo)準(zhǔn)品套裝
? 樣本來源于人類細(xì)胞系
? 變異位點(diǎn)頻率經(jīng)過數(shù)字PCR平臺(tái)驗(yàn)證
? 套裝包含三管產(chǎn)品，對(duì)應(yīng)三個(gè)AF梯度：0，0.1%，1%
? 涵蓋8個(gè)非小細(xì)胞肺癌熱門基因突變位點(diǎn)
? 標(biāo)準(zhǔn)品平均片段長(zhǎng)度為160bp，最/大程度模擬循環(huán)腫瘤DN**段分布
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參考資料：北京市臨床檢驗(yàn)中心, 北京醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì), 首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系, 等. 高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版腫瘤部分） [J] . 中華醫(yī)學(xué)雜志,2020,100 (09): 648-659. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.09.003