表面抗原密度
細胞攜帶的抗原或靶分子的數量與陽性群的強度直接相關, 并將決定與其匹配的最佳熒光素。
將熒光強度低的熒光素與高表達抗原配對, 將熒光強度強高的熒光素與低豐度抗原配對, 可以提高細胞群體的分辨率, 但是如何得知抗原密度呢？
本指南列出了一些常見的人和小鼠細胞表面標記物的抗原密度, 以幫助您選擇正確的熒光素。另外提供了如何使用抗體結合珠測量抗原密度的方法。
常見人標記物的抗原密度
新鮮分離的外周血細胞表面發現的常見標記物的抗原密度。
圖 1.21 種常見人類標記的數據。獲得每個表面標記物的幾何平均熒光強度，并將其轉換為抗原密度, 并以對數刻度繪制。圖中結果來自于正常人外周血的 4 次獨立實驗結果。在 Bio-Rad ZE5 流式細胞分析儀上獲取數據并在 FlowJo 中進行結果分析。
熒光素亮度
本示例說明了 CD4 與更亮熒光素（PE）配對可以提高分辨率。
圖 2. 熒光素的相對亮度。外周血 CD4 染色的示例顯示了 3 種熒光團從暗（Pacific Blue）到亮（PE）的相對亮度。顯示的數據是在 Bio-Rad ZE5 流式細胞分析儀上獲得的。
常見小鼠標記物的抗原密度
C57BL/6 小鼠的新鮮分離的脾臟細胞表面的常見標記物的抗原密度。
圖 3.16 種常見小鼠標記物的數據。獲得每個表面標記物的幾何平均熒光強度, 并將其轉換為抗原密度, 并以對數刻度繪制。圖中數據來自于 C57Bl/6 小鼠的 3 次獨立實驗的結果。在 Bio-Rad ZE5 流式細胞分析儀上獲取數據并在 FlowJo 中進行結果分析。
熒光素配對
為了獲得最佳結果, 應將低密度抗原與明亮的熒光素配對, 將高密度抗原與較暗的熒光素配對。
圖 4. 染色示例。 A, 人外周血單核細胞用 CD14 A700 和 CD163 A488 染色。B, 小鼠骨髓細胞用CD11b PB 和 GR-1 FITC 染色。在 Bio-Rad ZE5 流式細胞分析儀上獲取數據。
| 星光染料分類 | 已上市和待上市染料 |
| StarBright Blue
（488 nm） |
SBB510,SBB575,
SBB610,SBB670, SBB700,SBB750, SBB780 |
| StarBright Violet
（405 nm） |
SBV440,SBV475,
SBV515,SBV570, SBV610,SBV670, SBV710,SBV760, SBV790 |
|
StarBright UV （355 nm） |
SBUV400,SBUV445,
SBUV510,SBUV575, SBUV605,SBUV665, SBUV750,SBUV795 |
全新流式染料星光系列：更亮的亮度, 更窄的發射波普, 緩沖液兼容性好, 染色一致性好（具體見上表）。
四個簡單步驟測量抗原密度
Quantum 系列校準微球有 FITC 和 PE 兩種熒光標記可選根據對應的檢測抗體的熒光素來選擇, 微球大小近似于人類淋巴細胞, 中級強度的試劑盒可以很好地涵蓋典型細胞樣品的范圍。結合標準曲線, 可以計算待檢測抗原的密度。該種方法也可用于確定流式細胞儀線性度。
1、滴定抗體
通過合適的抗體濃度找到最佳的染色指數。
2、微球染色
確保微球的量是飽和的。珠子的熒光強度隨著抗體結合能力 ( ABC ) 而增強。
3、創建標準曲線
使用半高/全寬門測量幾何平均值, 創建針對抗體結合能力的熒光標準曲線。
4、測量抗原密度
使用陽性群體的幾何平均熒光強度, 可以計算感興趣細胞上任何抗原的密度。
Bio-Rad 于 2013 年 1 月收購了知名抗體公司 AbD Serotec。該公司成立于 1982 年, 總部位于英國牛津。提供上萬種抗體和免疫學試劑、單抗制備和多種規模的抗體生產和標記服務。其宗旨為生產高質量的抗體和免疫學試劑。該公司擁有最具特色的大鼠 CD68 單抗（克隆號: ED1）; 抑制素 A 檢測試劑盒為**產品; 將 SpyTag 技術引入 HuCAL 平臺, 提供非動物來源的抗體定制服務。
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