定量蛋白組學的意義
人類基因組完整圖譜于2003年正式公布，這標志著生命科學的里程碑性事件——人類基因組計劃的順利完成，生命科學研究也進入了后基因組時代。這一計劃的初始目的是在基因層面研究人類疾病機制，設計基因藥物，進行精準醫療。但是時隔十多年年過去了，效果遠沒預期的理想。其中主要原因可能是，我們現有的研究工作和背景知識不足以將龐雜的基因組數據直接同人類疾病聯系起來。而蛋白組學能更直觀的將基因與疾病聯系起來，逐漸成為研究熱點之一。定量蛋白組學是將某一基因組或者某一復雜體系表達的全部蛋白質進行鑒定和精準定量的學科，是蛋白組學研究的重要分支。
20實際80年代中期出現了MALDI（基質輔助激光解吸附電離）和ESI（電噴霧電離）兩種軟電離方法，可以將蛋白質或者多肽離子化，從而引入質譜儀種進行定性和定量分析，從此生物質譜技術成為蛋白組學很重要的分析工具之一。
圖1. 生物質譜儀器。
利用生物質譜技術，主要有兩種蛋白組學研究策略：
Top-down strategy：Top-down（自上而下法）通常的做法是，先利用二維凝膠電泳分離蛋白，再將完整蛋白直接離子化后引入質譜分析，借助生信分析工具和蛋白數據庫進行數據比對，從而實現對蛋白的鑒定。
Bottom-up strategy：Bottom-up（自下而上法）通常的做法是，先將樣品用酶進行處理，多維色譜分離后引入質譜分析，再借助生信分析工具和蛋白數據庫進行數據比對，最后實現對蛋白的鑒定。
蛋白定量分為相對定量和絕對定量，由于電泳技術具有重復性差等缺點，而多維色譜能將樣品酶解物穩定分離，因此蛋白的絕對定量多采用自下而上的方法。雖然絕對定量似乎更為理想，但是絕對定量更為復雜和昂貴，而相對定量在很多時候就能滿足科研需求，因此，相對定量更為常用。利于質譜技術，可根據特定質譜峰的信號強度來確定蛋白質含量，主要的方法又分為非靶向定量蛋白組學（標記定量和非標記定量）和靶向定量蛋白組學。
標記定量主要分為體內標記（SILAC）和體外標記（iTRAQ，TMT）。
1 SILAC
SILAC (Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture) 的基本原理是通過培養，利用天然同位素（輕型）或者穩定同位素（中型/重型）取代相應氨基酸。經過5-6次傳代后，穩定同位素可以完全摻入到新合成的蛋白質中。不同標記的細胞或者蛋白等比例混合后，引入質譜鑒定。如果峰值呈現為1：1，則表示此蛋白的含量無差異。如果含有重型氨基酸的峰值偏高，說明重型氨基酸標記的組中此蛋白含量更高。SILAC的優點是蛋白標記效率高，傳代6-8代后，可達到90%以上，靈敏性高?？蓹z測水平極低的蛋白含量變化和翻譯后修飾，且樣本需求量小，每個樣本僅需幾十微克，缺點是耗時長。
圖2 SILAC原理和流程。
2 iTRAQ&TMT
iTRAQ（isobaric tagging for multiplexed relative and absolute protein quantitation）和TMT（tandem mass tag）是目前應用較廣泛的蛋白質定量方法之一。兩個方法的原理類似，都是化學體外標記方法。由于生產商不同（iTRAQ的生產商為為AB Sciex， TMT的生廠商為Thermo Fisher），所以標記規格和標簽分子結構有差異。這兩種方法可檢測出低豐度的蛋白，胞外蛋白，膜蛋白，胞漿蛋白，核蛋白等，可同時處理多個樣本，鑒定和定量的結果同時得出且準確，特別適用比較蛋白組分析，鑒定差異蛋白。
表1. iTRAQ和TMT標簽的差異。
|
標簽 |
生產商 |
標簽規格 |
|
iTRAQ |
AB Sciex |
4標，8標 |
|
TMT |
Thermo Fisher |
2標，6標，10標 |
iTRAQ原理：首先蛋白質被裂解形成多肽，然后利用iTRAQ試劑進行差異標記。iTRAQ標簽包含報告基團、平衡基團和肽反應基團。不同標簽的報告基團和平衡基團重量有差異，以4標為例，報告基團重量分別是：114，115，116，117Da，而平衡基團重量分別為31，30，29，28Da。因此，標簽的總重是一致的。同一肽段由不同標簽標記后具有相同的質荷比。串聯質譜中，碰撞誘導質量平衡集團丟失，因此同一多肽由于標簽不同，產生不同的報告離子，根據報告離子的信號強度從而推斷不同樣品間相同肽段的含量。
圖3 iTRAQ技術流程。
非標記（Label-free）蛋白質定量利用液質聯用技術將蛋白質酶解形成多肽后進行質譜分析，通過計算蛋白肽段的鑒定數目和色譜峰面積進行蛋白質相對定量。該方法的優點是無需昂貴的標簽做內標，且樣本制作過程簡單，由于操作步驟少，可盡量減少人為和系統誤差。但是數據分析相對標記定量而言難度更大更復雜，且重復性較差，對儀器的穩定性和重復性要求高。通過在樣本中添加已知含量的標準蛋白還可以實現絕對定量。
圖4 Label-free蛋白定量流程。
安必奇專業團隊結合精細的樣品制備與超高分辨率、高靈敏度的液相色譜-質譜聯用技術，可在細胞或組織類樣品中鑒定超過10000個蛋白，結合生物信息學分析，為您構建高通量蛋白質定量表達譜。
服務內容
我們的優勢
標記率高：標記效果穩定。
靈敏度高：樣本需求量少，通常每個樣品只需要幾十微克的蛋白量。
通量高：采用質譜定量，可同時鑒定并定量數百至數千種蛋白質。
重復性高：對實驗操作穩定性、重復性要求高，要求至少做三次技術重復或生物重復。
參考文獻：
1、代立朋. 基于液質聯用法的蛋白絕對定量技術開發及其在單抗類藥物臨床前藥代動力學研究中的應用[D]. 天津大學, 2014.
2、基于質譜的定量蛋白質組學技術發展現狀[J]. 生物技術通報, 2017(9)
轉載自公眾號：北京安必奇生物科技有限公司
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