在精準醫學時代，NGS已經迅速成為檢測多種體細胞變異、診斷疾病以及預測療效的手段之一，然而分析驗證過程仍然具有挑戰性。如果實驗室希望分析患者材料，就必須優化和驗證其工作流程，包括確定準確的檢測極限。

正是由于對NGS腫瘤檢測的日益普及，已經建立了多個檢測腫瘤變異的具體指南，這些指南建議，樣本應具有足夠的序列數據，最小平均覆蓋率為500Ｘ，以便能夠可靠地檢測出低至5%的等位基因突變頻率。然而，隨著新技術進步提升在低等位基因頻率和覆蓋偏差問題上的應用愈發重要，我們是否應該更進一步提高檢測極限？

日益重要的理論檢測極限

為了能夠發現和診斷疾病，有必要驗證NGS檢測的最低等位基因頻率。
尤其當考慮到不斷發展的趨勢并推動更高的測序準確性時，比如包括（但不限于）：

? 檢測極低水平下游離細胞DNA（cfDNA）的需要

? 含有大量腫瘤-正常DNA的異質組織樣本

? 無創產前分析

? 補償樣品中的不均勻覆蓋分布（例如，富含GC的區域）

此外，NGS實驗的理論檢測極限受分子特異性（去重復）、模板量和覆蓋深度等參數的影響。

建庫準備工作的選擇對其LOD的影響

基于擴增子

在傳統的擴增子組合中，使用相同序列的正向和反向引物生成短的擴增子，以特定區域為目標（如下圖所示灰色“reads”）。
這些相同的末端序列使得在PCR擴增過程中很難從那些“復制的”分子中分離出獨特的分子。理想情況下，只有獨特的分子才能被用來計算等位基因的突變頻率，以避免DNA擴增錯誤和偏差?！　?/span>

基于捕獲

相反，基于捕獲建庫則（下圖中）克服了這個問題，因為DNA首先被隨機剪切，生成可以消除歧義或消除重復的隨機起始/終止位點。但是，基于捕獲建庫的缺點是所需的模板量通常較高，可能不適合于來源困難的腫瘤。

不管建庫方法如何，使用已知的參考標準品測定實驗的檢測限通常被認為是良好的做法。

考慮到覆蓋偏差

重要的是，由于樣本的覆蓋分布不均勻，可能需要提高測序深度，以實現目標區域的覆蓋。
測序覆蓋深度也在檢測極限中起作用。如果你不受樣本材料的限制，那么下面的方程式的分母不受分子的限制，而是變成Reads數決定的：

同樣，假設需要四個包含目標突變序列的讀數來檢測0.01%或更低的等位基因頻率，那么這個區域的測序深度必須至少為40000X。

重要的是，由于樣本的覆蓋分布不均勻，可能需要進行更深入的測序，以實現目標區域40000×的覆蓋。當把實驗噪聲考慮在內時，實際的檢測極限可能會高得多。

覆蓋偏差示例

圖- Chen et al

數據集來源于金黃色葡萄球菌USA300（A）和金黃色葡萄球菌mrsa252 基因組（B）。讀值覆蓋深度是標準化的兩個平均值，代表水平線。垂直線A 表示平均GC含量。基于數據點的直線和斜率定義為“GC偏差程度。兩個用例分別代表負面和正面的GC的偏差。

結論

推動NGS理論檢測極限變得越來越重要，在實施到臨床工作流程之前，必須用已知的標準評估方法進行性能驗證。

為了能夠發現和診斷疾病，有必要驗證NGS實驗可能的最低等位基因頻率檢測能力。

相比組織檢測，液體活檢具有方便、快速、即時、便宜、微創的特點，這些特點使其迅速成為目前腫瘤基因檢測甚至是腫瘤早篩的研究熱門。

菁良基因肺癌ctDNA標準品套裝除了日常質控您的檢測流程外，其低至0.1%的突變頻率還可以幫助臨床實驗室根據本身實際情況，進行最低檢測限的驗證。

適用的液體活檢各過程：ctDNA提取，變異檢測，信息分析；

適用的檢測方法：NGS測序，PCR檢測等。

參考文獻

New York State Department of Health. (2014, January). "Next Generation" Sequencing (NGS) guidelines for somatic genetic variant detection.