來源：生物通

CRISPR技術紅得發紫，也備受詬病，其中的兩大問題在于脫靶效應和效率低。近期兩大權威雜志，Science和Nature分別公布了Broad研究所張鋒研究組和哥倫比亞大學Sam Sternberg研究組（剛從加州大學伯克利分校Jennifer Doudna實驗室轉入哥倫比亞大學）兩項相似的研究成果：利用細菌跳躍基因，將DNA序列精確地插入基因組而不切割DNA。

這兩項研究克服了CRISPR技術的主要缺點，為基因工程和基因治療提供了一種強有力的新選擇。

“跳躍基因”又叫轉座子，它們無處不在，每個生命領域都攜帶這些DNA序列，它們利用轉座酶從一個位置“跳”到另一個位置，事實上，有接近一半的人類基因組是由跳躍基因組成的。

張鋒研究組從藍藻中抽提了一種轉座酶，他們將其命名為CAST，即CRISPR相關轉座酶（CRISPR-associated transposase）。Sternberg研究組的新技術則稱為INTEGRATE（Insertion of transposable elements by guide RNA-assisted targeting），利用跳躍基因將DNA序列插入基因組而不切割DNA。

“目前的工具就像分子剪刀，切割DNA，但實際編輯是由細胞自身的DNA修復機器完成的，”Sternberg博士說。 “你是受到細胞的支配，來完成這項工作的。”

而新技術更像分子膠而不是分子剪刀。

“不用引入DNA斷裂，依賴細胞來修復斷裂，INTEGRATE可以直接在基因組的精確位置上插入用戶定義的DNA序列，這是分子生物學家幾十年來一直尋求的能力。”

現有的CRISPR工具太挑剔

利用目前的編輯工具來修改細胞的基因組，就像是使用文字處理器編輯一個很大的文檔，而且這個軟件還有自己的想法。

通常，研究人員希望在一個特定的DNA堿基序列上做一個小的改變，基因組的其余部分保持不變。目前較好的工具：CRISPR-Cas系統可以在特定序列切割DNA分子的兩條鏈，就像是在一段文本中添加段落。

這些斷裂其實只是開頭，實際的“編輯”是由細胞自身的DNA修復機制完成的，然后用研究人員提供的DNA序列來填補空白。

依靠細胞的修復機械有很大的局限性。許多細胞無法正確地修復DNA斷裂或在這個過程中引入錯誤，此外，DNA斷裂還會引發DNA損傷反應，產生其它不良影響。

因此，這使得某些細胞類型中的基因編輯變得困難或不可能，嚴重限制了研究人員安全的引入精確遺傳修飾。

CAST系統

張鋒的CAST系統將Cas9切刻酶（D10A）偶聯到單鏈DNA轉座酶TnpA上，然后在大腸桿菌基因組中檢測到了這種蛋白復合物能夠促進外源DNA的定點整合，這說明利用轉座子可以實現基因敲入，不過單鏈DNA模板的制備和體內遞送還存在問題。

研究人員分別測試了不同CAST基因和不同長度的tracrRNA對CAST系統的活性的影響。結果發現4種CAST基因對于外源基因整合是必需的，同時216 bp的tracrRNA足以產生外源基因的整合，并且他們還證實這種基因整合只發生一次，從而避免了多次基因插入。

CAST基因敲入系統不是簡單的修修補補，而是從頭開始設計，并從大自然進化的生物中尋求完整的解決方案，從而突破了原有系統的瓶頸，實現了基因敲入效率的跨越式提升。

INTEGRATE系統

INTEGRATE系統則來自霍亂弧菌。

Sternberg等人為了找到新的基因編輯工具，搜尋細菌，找到了一個獨立的DNA編輯系統，這一系統具有不尋常的特性，不需要依靠細胞的幫助。

他們發現將轉座子整合到細菌基因組中的特定位點，利用單獨的酶將轉座子送入基因組，而不是將DNA切割成兩個，即酶（整合酶）插入DNA的位點完全由其CRISPR系統控制。

研究人員利用這一發現創建了一種基因編輯工具，將任何DNA序列插入細菌基因組的任何位點。與CRISPR一樣，整合酶通過導向RNA找到合適的位點，精確控制供體DNA整合的位置。再通過用其它DNA有效載體替換轉座子序列，將長達10,000個堿基的序列插入細菌基因組中。因此，與其它基于整合的編輯工具不同，INTEGRATE技術是迄今為止研究的第一個完全可編程的插入系統。

研究人員在編輯過的細菌進行測序證實，INTEGRATE實現了精確插入，在非目標位置沒有額外的拷貝。

改進基因編輯

這項技術能夠帶來廣泛的新基因編輯機會。許多生物技術產品，包括基因治療和細胞療法，工程化作物和生物制劑，都需要精確整合。

INTEGRATE技術也提供了一種全新的方法，既有與CRISPR-Cas9相同的可編程性和易用性，又沒有與DNA斷裂相關的副作用。

“我們可以對這種CRISPR轉座子系統進行編程，將其整合到幾乎任何基因組位點，之后再通過深入了解其工作原理，我們將能夠設計更有效的系統，”Sternberg說。

下一步，Sternberg的團隊將檢測其他細胞類型，包括哺乳動物細胞。Sternberg說，我們有充分的理由相信精確的DNA整合在哺乳動物細胞中能起到和大腸桿菌中一樣的作用，為基礎研究和最終的臨床應用打開了新的大門。

（生物通：萬紋）

原文標題：

Transposon-encoded CRISPR-Cas systems direct RNA-guided DNA integration,