蛋白質組學是一種大規模的蛋白質分析方法，它對我們理解后基因組時代的基因功能具有重要意義。蛋白質組學可分為三個主要領域:(1)用于大規模鑒定蛋白質的蛋白質微觀特征及其翻譯后修飾;(2)差異顯示蛋白組學，比較蛋白水平在多種疾病中的潛在應用;(3)利用質譜或酵母雙雜交系統等技術研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用。蛋白質組學在系統生物學工作流程中起著核心作用，是對轉錄組和代謝組分析的補充。例如，目前很難從mRNA的豐度來預測細胞蛋白濃度，盡管有研究發現轉錄水平與所有蛋白質的子集豐度呈正相關。當蛋白質在體內發揮其功能的時候不是各司其職的單干，蛋白質們會通過相互作用形成復合體然后進行團隊合作，在工作的過程中，蛋白質們也會更改相互作用的伙伴，進而改變蛋白質復合體的功能。人們將蛋白之間的互作（PPI）構建成網絡如圖1，以此來揭示細胞生命活動的各個過程，對調控細胞及其信號有重要意義。

圖1. 蛋白互作網絡

因此，研究蛋白質的相互作用成為研究蛋白質功能和作用機制的重要的環節之一。如果我們要研究一個蛋白與另一個蛋白或另外一些蛋白是否具有相互作用，首先就要先找到這個蛋白，再從中找到其他相關聯的蛋白，最終達到我們的實驗目的。研究蛋白互作的方法可謂是五花八門，今天就帶大家了解相關的實驗方法，大家可以從中形成最適合自己套路發篇paper。

一、 酵母雙雜交系統

酵母雙雜交是一個古老的技術，Stanley Fields 和 Ok-KyuSong 在 1989 年的時候利用大腸桿菌中 GAL4 乳糖操縱子的原理，開發出這個方法用于檢測蛋白質之間的相互作用。酵母雙雜交系統是一種強大的體內方法，用于識別編碼蛋白的新基因與感興趣的蛋白相互作用。該系統提供了一些創新的識別相互作用的蛋白質超過傳統的生物化學方法。該雙雜交系統是第一個檢測相互作用蛋白的遺傳和分子方法，該檢測是在體內而不是在體外進行的，這使得檢測相互作用蛋白的天然結構成為可能。因此，雙雜交系統具有高超的靈敏度，以檢測微弱和短暫的蛋白質相互作用。

值得注意的是，酵母半乳糖代謝途徑的全局轉錄激活因子GAL4由DNA結合域(DNA-BD)和激活域(AD)組成。DNA-BD識別并與gal4反應基因上游區域的一個序列(UAS)結合，而AD則與啟動轉錄所需要的機制的其他組件相聯系。這兩個區域的存在，如果是物理隔離，則不足以激活反應基因。

因此，在酵母雙雜交系統中，兩個GAL4結構域分別被編碼相互作用蛋白的基因所分割，重組雜交蛋白在酵母中表達。這兩種雜交蛋白的相互作用使兩個GAL4結構域足夠接近，形成一個功能激活因子，激活報告基因的轉錄，使蛋白質相互作用表型可檢測，即lacZ 的表達，使得人們可以檢測到，如下圖。

圖2. 酵母雙雜交原理示意圖

二、 Co-IP & GST pull-down

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是用于研究蛋白互作很好的方法。它的優點是直接有效，以抗原抗體特異結合為原理。細胞內天然存在PPI。我們首先將細胞破碎裂解，再將我們的目的蛋白的抗體預先結合在agarose beads上，用這樣的agarose beads與我們的細胞破碎產物孵育一段時間后回收。再通過跑PAGE，對與目的蛋白互作的蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。

GST pull-down與Co-IP方法類似，不同之處在于GST pull-down是體外研究蛋白互作，而Co-IP多用于細胞內互作。該方法利用一種帶有GST-Tag的融合蛋白來拉互作的蛋白，然后用可結合GST標簽的瓊脂糖珠將融合蛋白吸附沉淀，經SDS-PAGE分離，同理我們也可以把其他標簽加在蛋白，比如Strep、FLAG、MYC等。但是這種方法無法說明蛋白天然互作的情況。

圖3. Co-IP過程

三、 串聯親和純化-質譜

無論使用哪種標簽作為誘餌蛋白來拉我們要找的蛋白都只能起到一個粗提作用，當這個蛋白是已知或是實驗前推測有聯系時，我們可以做Western Blot進行驗證，但是如果發現一種新的未知互作關系時就需要一種高通量、高分辨率的技術，這就是質譜。

親和純化步驟與Co-IP一致，但單標簽純化效率低下，而且殘留的雜蛋白較多；因此逐漸發展成為雙標簽純化。親和純化可以采用任何兩種標簽組合，但值得注意的是，并沒有一種標簽組合是百分百理想的。標簽的選擇主要是根據標簽的特性，目的蛋白本身的屬性，比如穩定性、可溶性，以及標簽與目的蛋白的融合性。將親和純化得到的蛋白復合物聯合質譜技術進行鑒定。

四、 表面等離子共振

自20世紀80年代初，表面等離子體共振首次被用于金屬表面過程的研究和氣體傳感以來，SPR生物傳感器已成為表征和定量生物分子相互作用的中心工具。此外，用于檢測化學和生物物種的SPR傳感器的發展也得到了相當大的發展，用于檢測與醫學診斷、環境監測、食品安全和安全有關的分析物的SPR生物傳感器的出版物數量也在迅速增長。

圖4. 表面等離子體共振原理

與上述這些非成像技術相比，該成像技術在空間上解析蛋白互作，允許使用高通量微陣列技術對每個蛋白進行詳細研究，并對不同的蛋白進行多路檢測，而不會損害敏感區域。熒光檢測是一種應用廣泛的成像技術，它可以對標記有染料分子的蛋白進行成像。然而，無標簽技術是非常需要的，因為它們消除了標簽對蛋白功能的可能影響。更重要的是，與基于標簽的方法不同，無標簽技術直接測量蛋白的內在物理特性，提供額外的信息，如每個蛋白的質量和大小。表面等離子體共振成像(SPRi)是一種無標簽的原位檢測和分子結合研究技術。

參考文獻：

• Shtenberg, Giorgi, et al. Picking up the Pieces: A Generic Porous Si Biosensor for Probing the Proteolytic Products of Enzymes. Analytical Chemistry 85.3(2013):1951-1956.

• Grashoff, Carsten, et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature 466.7303(2010):263-266.