急性缺血性卒中是一種由腦血管閉塞而引起的腦組織缺血及缺氧壞死，有可能造成毀滅性和永久性的中樞神經損傷，這一病理過程涉及線粒體氧化磷酸化功能障礙和細胞生物能量應激。低密度脂蛋白受體相關蛋白 (LRP1)是一種多功能的跨膜受體，可調節血腦屏障完整性、神經元穩態、能量代謝等眾多細胞過程，但在缺血性卒中過程中的作用仍不明確。
2024年6月，西南醫科大學附屬醫院、四川大學華西醫院和中國科學技術大學團隊在Cell Metabolism上發表了題為“Astrocytic LRP1 enables mitochondria transfer to neurons and mitigates brain ischemic stroke by suppressing ARF1 lactylation”的研究論文，揭示了星形膠質細胞中的LRP1通過抑制葡萄糖攝取、糖酵解和乳酸生成，導致ADP-核糖基化因子1 (ARF1)的乳酸化水平降低，進而促進了線粒體向受損神經元的轉移，并緩解缺血導致的器官損傷。（麥特繪譜提供[U-13C]葡萄糖、[U-13C]L-谷氨酰胺、[U-13C]乙酸代謝流檢測服務）
技術路線圖
分析結果
1. LRP1缺失會抑制線粒體從星形膠質細胞向神經元轉移
已有研究表明，星形膠質細胞可釋放健康的線粒體到鄰近的神經元，以此來使受損的神經元恢復健康?；谶@一假設，研究者利用慢病毒轉染設計了LRP1敲減的星形膠質細胞（記為shLrp1）。首先觀察到培養基中細胞外線粒體數量降低，且伴隨耗氧量和ATP減少，說明敲減LRP1抑制星形膠質細胞釋放線粒體；隨后分離星形膠質細胞中的線粒體，將之與神經元共培養，熒光顯微鏡證實，敲減LRP1抑制星形膠質細胞的線粒體向神經元轉移；最后進行氧-糖剝奪（OGD）和恢復實驗，發現敲減LRP1后的新型膠質細胞失去了恢復神經元活性的能力。
圖1. LRP1促進星形膠質細胞的線粒體向神經元轉移
2. LRP1缺失會增加星形膠質細胞的糖酵解及乳酸水平
線粒體在細胞能量代謝中發揮著核心作用，因此研究者推測LRP1介導的線粒體轉移可能與能量代謝有關?；诖藢hLrp1及對照的星形膠質細胞進行靶向代謝組學分析，發現shLrp1細胞內，葡萄糖、糖酵解中間產物：甘油醛3-磷酸和乳酸，以及部分TCA中間體的水平上升，同時ECAR/OCR比率及ATP生成速率也顯著增加。表明敲減LRP1后，星形膠質細胞內糖酵解相對于氧化磷酸化增強。
為進一步確認糖酵解增強是否由葡萄糖攝取的增加引起，研究者使用[U-13C]葡萄糖進行代謝流檢測。結果顯示，與對照組相比，敲減LRP1顯著增加了星形膠質細胞的葡萄糖攝取。隨后研究者試圖用同樣的方法確認增加的乳酸是否來源于糖酵解：使用[U-13C]葡萄糖、[U-13C]L-谷氨酰胺或[U-13C]乙酸分別標記星形膠質細胞，追蹤并分析13C進入乳酸及TCA循環代謝物中的情況（代謝流技術由麥特繪譜提供）。結果顯示，大多數乳酸由葡萄糖生成，同時敲減LRP1提高了星形膠質細胞中的乳酸水平。
圖2. 敲減LRP1可增強星形膠質細胞的糖酵解和乳酸代謝
3.乳酸抑制星形膠質細胞釋放功能性線粒體
接下來試圖確定乳酸的增加是否影響星形膠質細胞的線粒體釋放。作者分別抑制了能量代謝過程中可調節乳酸生成的不同環節，隨后觀察星形膠質細胞細胞內乳酸、細胞外線粒體及ATP等指標的變化。這些抑制實驗包括：
● 缺氧處理，誘導無氧糖酵解發生
● 魚藤酮處理，抑制線粒體呼吸鏈，即氧化呼吸過程
● 2-DG處理，抑制糖酵解從而抑制乳酸上游的丙酮酸合成
● LDHA/B選擇性抑制劑，抑制乳酸脫氫酶活性，干擾乳酸生成
● 敲除Ldha和Ldhb基因，完全阻斷乳酸和丙酮酸的相互轉換
圖3. 調節乳酸產生的各種代謝調節劑
結果表明，抑制丙酮酸合成或者抑制乳酸脫氫酶活性后，均觀察到乳酸生成減少，并伴隨著細胞外線粒體和ATP水平的增加。進一步地，為了測試乳酸是否調節星形膠質細胞的線粒體釋放，使用梯度劑量的乳酸培養細胞，發現乳酸處理以劑量依賴的方式降低細胞外線粒體和ATP水平。
圖4. 乳酸抑制星形膠質細胞釋放線粒體
綜上，這些發現表明LRP1通過抑制星形膠質細胞中的乳酸增加線粒體釋放。
4. ARF1 K73乳酸化介導LRP1誘導的線粒體釋放
已知乳酸分子可以與蛋白質中的氨基酸殘基發生酯鍵結合，即發生蛋白的乳酸化修飾，因此研究者假設LRP1可能是通過乳酸化修飾來發揮作用。利用乳酸化蛋白質組學技術對shLrp1和對照星形膠質細胞進行檢測，共鑒定到136個差異修飾蛋白和163個差異修飾位點，其中細胞質中乳酸化程度最高的是ARF1 (ADP-核糖基化因子1)的第73位賴氨酸。接下來對該蛋白進行功能分析，從基因本體注釋的分子功能和細胞成分方面來看，ARF1與LRP1的功能相似性最高；且蛋白互作網絡分析也發現ARF1在線粒體釋放中具有潛在的功能。
為進一步驗證ARF1-kla73是否是線粒體釋放的關鍵介質，對ARF1的73號位賴氨酸位點進行了突變：突變為谷氨酰胺的K73Q（激活乳酸化）和突變為精氨酸的K73R（抑制乳酸化）。隨后觀察到K73R突變體的ARF1活性受到抑制，且伴隨線粒體釋放上調的現象。反之，激活乳酸化修飾的K73Q突變體則會抑制線粒體的釋放。
圖5. ARF1 K73乳酸化介導的LRP1誘導-線粒體釋放
以上結果說明，乳酸通過ARF1-Kla73減少星形膠質細胞的線粒體釋放。
5. 體內驗證LRP1-乳酸軸與線粒體轉移和腦損傷的關系
最后進行動物模型驗證，采用大腦中動脈閉塞術(MCAO)構建小鼠腦缺血再灌注（I/R）損傷模型，發現敲減LRP1的小鼠在MCAO手術后腦梗死區域更大，神經功能也更差。此外，在梗死區域邊緣的神經元內線粒體數量、特別是來自星形膠質細胞的線粒體減少，并且這些神經元的線粒體功能受損。
圖6. LRP調控的星形細胞線粒體轉移可減輕腦I/R損傷
隨后進一步測試了上述腦損傷過程中ARF1-K73乳酸化的作用。首先，分別對LRP1特異性敲減的小鼠進行K73Q和K73R過表達造模，發現與對照相比，K73R過表達小鼠腦脊液和神經元中星形膠質細胞來源的線粒體更多，K73Q過表達組則與之相反。隨后再次進行MCAO誘導的腦損傷實驗，發現與對照組相比，K73R處理組小鼠梗死面積減少，神經功能改善，星形膠質細胞來源的線粒體數增加，而K73Q處理組的表型變化與之相反。
為了確定上述研究結果的臨床相關性，研究者量化了人類卒中患者和正常受試者的腦脊液乳酸水平，發現與正常對照相比，缺血性腦卒中患者腦脊液乳酸水平明顯升高，且乳酸水平與梗死面積呈正相關，而與腦脊液星形細胞線粒體呈負相關。
圖7. 星形膠質細胞的ARF1-K73乳酸化會減少線粒體轉移，從而加重腦I/R損傷
以上結果支持了乳酸可降低線粒體轉移并加重腦I/R損傷的結論。
研究結論
本研究使用體外細胞實驗、穩定同位素示蹤（代謝流）檢測和乳酸化修飾蛋白質組學檢測等技術方法，研究了星形膠質細胞LRP1調節健康線粒體從星形膠質細胞向神經元的轉移，并保護免受腦缺血再灌注(I/R)損傷的現象。在機制方面發現了乳酸鹽抑制功能性線粒體轉移并加重I/R損傷。
本研究為理解線粒體穩態缺血性卒中發生發展過程中的作用機制提供了新的視角，為開發缺血性卒中的治療提供了新的策略。
圖8. 全文總結
參考文獻
Zhou J, Zhang L, Peng J, et al. Astrocytic LRP1 enables mitochondria transfer to neurons and mitigates brain ischemic stroke by suppressing ARF1 lactylation. Cell Metab. 2024.
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