Fig.1 SARS-CoV-2病毒種類及分布，紅色為親和力增強型毒株；

黃色突變毒株親和力與原型毒株無明顯差異

由于RBD是結合人ACE2并啟動細胞進入的唯一結構域，通常認為RBD應高度保守。但是多態性和差異性分析表明，與S蛋白的其他區域類似，RBD序列也呈現多樣性^[3]。

已公布基因組序列的1609個SARS-CoV-2毒株中，經多態性分析發現有32個毒株在RBD中含有氨基酸突變。這些毒株來自多個地區，包括中國，英國，芬蘭，法國，比利時，美國和印度。大多數突變體與最先發現的基因組（SARS-CoV-2 WuHan-Hu-1）相比，僅相差一個氨基酸。進一步分析得出32個RBD突變型分為10種類型（Fig. 1）^[3]。

利用分子動力學模擬分析比較原型毒株SARS-CoV-2（SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1）RBD蛋白和突變型毒株的RBD蛋白與人ACE2的結合能力。分析結果顯示與原型毒株RBD蛋白相比，三個RBD突變蛋白（N354D&D364Y，V367F，W436R）的ΔG均為-200 kJ / mol，比原型毒株低約25%，與人ACE-2的親和力顯著提高^[3]。

RBD與ACE2的結合界面主要是無規卷曲構象，因而缺乏結構上的剛性。通過增加骨架的剛性可以維持相互作用表面的結合構象，從而提高親和力。以殘基510-524為中心的β折疊結構就起到了這種支架的作用，該區域附近的突變體N354D，D364Y，V367F和W436R在結構上增加了剛性作用，同時這些突變位點導致結合位點區域的ΔG總體降低，增加了結構的穩定性，這些因素共同導致了突變體RBD與ACE2親和力的提高。

另外，ACE2表面附近帶大量負電荷，而突變體W436R提供了帶正電的氨基酸。這種潛在的靜電作用力可能有助于親和力的提高。

Fig. 2 RBD突變體的結構分析及其結合親和力的影響：

突變氨基酸和片段510-524的空間位置

ACROBiosystems SARS-CoV-2 RBD突變蛋白驗證ELISA Binding Assay結果顯示，所有RBD突變蛋白與人ACE2受體蛋白結合活性均高于原型毒株RBD蛋白, RBD (V367F) EC50: 0.31nM > RBD (W436R) EC50: 0.89nM > RBD (N354D, D364Y) EC50: 0.97nM > 原型毒株RBD EC50: 1.47nM (Fig. 3)。

Fig. 3 Human ACE2與 SARS-CoV-2 RBD蛋白結合活性ELISA比較

BLI驗證發現，突變蛋白 RBD(V367F)，RBD (W436R)和RBD (N354D, D364Y) 與ACE2的親和力均達到nM水平, KD值分別為5.5nM, 6.85nM和6.32nM，比原型毒株RBD與ACE2 受體蛋白親和力（24.4nM）高3倍以上（Fig. 4）。

Fig. 4 BLI技術驗證Human ACE2與 SARS-CoV-2 RBD蛋白親和力

與BLI檢測結果類似，SPR原型毒株RBD與人ACE2受體蛋白親和力為13.1nM，突變蛋白RBD(V367F)，RBD (W436R) 和RBD (N354D, D364Y)的KD值分別為4.33nM、6.96nM和7.57nM（Fig. 5）。

Fig. 5 SPR技術驗證Human ACE2與 SARS-CoV-2 RBD蛋白親和力