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【重磅新品】快速評估tLNP遞送潛力—DTrack?內(nèi)吞效率檢測方案

作者：北京百普賽斯生物科技股份有限公司暫無發(fā)布時間 (訪問量:1991)

In vivo CAR-T正迅速成為細胞治療領(lǐng)域最受關(guān)注的前沿賽道之一。近期，Kelonia、南京傳奇等企業(yè)陸續(xù)公布積極的臨床進展，再次點燃了市場對這一“下一代CAR-T”技術(shù)路線的期待。與傳統(tǒng)CAR-T需要經(jīng)歷細胞采集、體外基因修飾和回輸?shù)葟碗s流程不同，In vivo CAR-T通過遞送系統(tǒng)直接在患者體內(nèi)生成CAR-T細胞，有望實現(xiàn)更低成本、更短治療周期以及更廣泛的患者可及性。其中，靶向脂質(zhì)納米顆粒（targeted Lipid Nanoparticles，tLNP）憑借高效、安全的核酸遞送能力，已成為當前最具潛力的技術(shù)平臺之一。tLNP能夠?qū)AR編碼mRNA精準遞送至T細胞，在體內(nèi)原位生成CAR-T細胞。目前，該策略已在腫瘤、自身免疫疾病及心血管疾病等多個領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的治療潛力。然而，盡管研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種針對不同T細胞表面受體的tLNP系統(tǒng)，不同靶點之間的遞送效率和體內(nèi)CAR-T生成能力仍存在顯著差異，其背后的作用機制尚未完全明確。

靶向脂質(zhì)納米顆粒（tLNP）示意圖

（來源：Science (New York, N.Y.) vol. 388,6753 (2025): 1311-1317.）

tLNP內(nèi)吞效率：驅(qū)動體內(nèi)CAR-T生成的核心引擎

近日，Capstan Therapeutics聯(lián)合創(chuàng)始人Hamideh Parhiz團隊發(fā)表重要研究，首次系統(tǒng)評估了不同T細胞靶向受體對tLNP遞送效率的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)認知不同，靶受體的表達豐度并非決定遞送效果的關(guān)鍵，受體內(nèi)吞效率才是影響mRNA遞送和體內(nèi)CAR-T生成效率的核心因素。這一發(fā)現(xiàn)為下一代In vivo CAR-T遞送載體設(shè)計提供了全新思路。

該研究系統(tǒng)比較了靶向CD2、CD4、CD5、CD7、CD8及CD4/CD8雙靶向tLNP在原代人T細胞中的mRNA遞送能力，并揭示了影響遞送效率的關(guān)鍵因素。

① 豐度不等于高效率：轉(zhuǎn)錄組及流式分析均證實，CD2是T細胞表面表達量最高的受體，其蛋白水平是CD7的2倍以上，是CD5的3倍以上。按傳統(tǒng)“豐度決定論”，靶向CD2的tLNP應(yīng)表現(xiàn)最優(yōu)。然而事實截然相反：aCD2/tLNP的遞送效率僅排第三，且蛋白表達強度（MFI）僅為aCD7/tLNP的五分之一。也就是說，T 細胞表面受體豐度高，并不能保證特異性靶向該受體的 tLNP 擁有更高的 T 細胞轉(zhuǎn)染效率。

② 內(nèi)吞動力學是決定性指標：為探究差異根源，研究者利用pH敏感的FabFluor標記系統(tǒng)，對受體-抗體復合物的內(nèi)化過程進行了實時定量監(jiān)測。結(jié)果顯示：aCD7抗體表現(xiàn)出最高的內(nèi)吞水平，在4小時監(jiān)測窗口內(nèi)，aCD7的內(nèi)化信號遠超CD71（CD71是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，經(jīng)典的高內(nèi)吞陽性對照），而aCD2的內(nèi)化信號極弱。

③ RNA胞內(nèi)積累與內(nèi)吞水平呈高度正相關(guān): 通過Cy5熒光標記mRNA示蹤，研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)mRNA的積累量與抗體-受體內(nèi)化水平呈高度正相關(guān)（Pearson r = 0.894, p < 0.0001）。aCD7/tLNP處理組在4小時即展現(xiàn)出最高的胞內(nèi)mRNA信號。

④ 高內(nèi)吞效率的aCD7/tLNP實現(xiàn)高效體內(nèi)CAR-T細胞生成：在人源化小鼠模型中，裝載抗CD20 CAR mRNA的aCD7/tLNP，以2.5 μg/只的低劑量，在24小時內(nèi)即在脾臟中成功生成CAR-T細胞（CD4+ T細胞中約25%表達CAR，CD8+ T細胞中約40%表達），并驅(qū)動了近乎完全的B細胞清除。這一效率顯著優(yōu)于同條件下對照的aCD2/tLNP，且血清生化分析顯示良好安全性。

結(jié)語

本研究首次系統(tǒng)證明，在T細胞靶向遞送過程中，受體內(nèi)吞效率而非受體表達豐度，才是影響mRNA遞送效率和體內(nèi)CAR-T生成效果的關(guān)鍵因素。這一發(fā)現(xiàn)提示，企業(yè)在開展In vivo CAR-T遞送系統(tǒng)開發(fā)時，應(yīng)將受體內(nèi)吞能力納入關(guān)鍵評價指標，通過建立相關(guān)檢測和監(jiān)測體系，為遞送靶點篩選及載體優(yōu)化提供更科學的決策依據(jù)。與此同時，受體內(nèi)吞水平的檢測還具有重要的研發(fā)前移價值，相比于等待CAR表達結(jié)果甚至體內(nèi)藥效數(shù)據(jù)來驗證遞送方案優(yōu)劣，內(nèi)吞效率評估能夠在研發(fā)早期快速識別潛在問題，提前篩除低效靶點或遞送策略，從而減少試錯成本、縮短開發(fā)周期，加快方案迭代優(yōu)化。對于競爭日趨激烈的In vivo CAR-T賽道而言，將關(guān)鍵評價指標前置，或?qū)⒊蔀樘嵘邪l(fā)效率和成功率的重要策略。目前，In vivo CAR-T的發(fā)展仍處于加速演進階段，隨著遞送等機制的不斷闡明，更多關(guān)鍵影響因素將被識別和利用，研發(fā)效率持續(xù)提升，加速推動In vivo CAR-T從臨床創(chuàng)新邁向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

【重磅新品】DTrack™內(nèi)吞效率檢測方案

隨著In vivo CAR-T遞送技術(shù)的快速發(fā)展，scFv和VHH憑借分子量小、空間位阻低、免疫原性較低等優(yōu)勢，已成為當前tLNP表面靶向修飾的主流抗體形式。針對In vivo CAR-T開發(fā)過程中缺乏高效、便捷的tLNP內(nèi)吞效率檢測工具這一研發(fā)痛點，ACROBiosystems百普賽斯重磅推出一系列適配IgG、scFv（G4S Linker、218 Linker）及VHH等不同抗體形式的DTrack™ pH敏感染料標記通用型抗體，可用于tLNP內(nèi)吞效率的快速檢測，幫助研發(fā)人員評估遞送潛力、篩選最優(yōu)靶向配體，為實現(xiàn)高效體內(nèi) CAR-T 細胞工程化構(gòu)建提供實踐依據(jù)。

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檢測原理

產(chǎn)品優(yōu)勢

產(chǎn)品覆蓋全面: 針對lgG、scFv、VHH等主流tLNP靶向配體，提供完整的內(nèi)吞檢測產(chǎn)品體系。

檢測精準可靠: pH敏感染料”關(guān)-開"式熒光設(shè)計，低背景、高噪比，精準反映受體內(nèi)吞過程。

研發(fā)效率提升:加快高潛力配體篩選與遞送體系優(yōu)化。

驗證數(shù)據(jù)

PH敏感染料標記的Anti-G4S linker antibody與含有G4S linker的LNP表面修飾Anti-CD8 antibody結(jié)合后通過與T細胞表面的CD8受體結(jié)合發(fā)生內(nèi)吞，在胞內(nèi)酸性環(huán)境中可檢測到紅色熒光信號，進而可判斷tLNP的內(nèi)吞效率。

tLNP-hCD8 scFv Ab (containing G4S linker) and negative control tLNP were labeled with PH Sensitive Anti-G4S Linker Labeling Reagent (Cat. No. G4S-PZF25C1). CD3+ T cells were separately treated with pH-sensitive Dye-Labeled tLNP-hCD8 scFv Ab conjugates or negative control for 4 hours, then analysis by Flow cytometric. APC signal was used to evaluate the activity.

申請Protocol

PH敏感染料標記的Anti-VHH antibody與LNP表面修飾的Anti-CD8 VHH antibody結(jié)合后通過與T細胞表面的CD8受體結(jié)合發(fā)生內(nèi)吞，在胞內(nèi)酸性環(huán)境中可檢測到紅色熒光信號，進而可判斷tLNP的內(nèi)吞效率。

tLNP-hCD8-Ab (VHH format) were labeled with PH Sensitive Anti-Camelid VHH (M1A11) Labeling Reagent (Cat. No. CAH-PZF2491a). CD3+ T cells were separately treated with pH-sensitive Dye-Labeled tLNP-hCD8 VHH Ab conjugates or pH-sensitive Dye alone for 4 hours, then analysis by Flow cytometric. APC signal was used to evaluate the activity.

申請Protocol

PH Sensitive Anti-Human IgG Labeling Reagent檢測偶聯(lián)CD8抗體（human Fc）的LNP內(nèi)吞。試劑與LNP表面抗體結(jié)合并內(nèi)吞進入酸性內(nèi)體或溶酶體后可檢測到紅色熒光。

tLNP-hCD8 Ab and LNP-Human IgG1 Kappa Isotype Control were labeled with PH Sensitive Anti-Human IgG Labeling Reagent (Cat. No. IGG-ZFS307). CD3+ T cells were separately treated with pH-sensitive Dye-Labeled tLNP-hCD8 Ab or isotype control conjugates for 4 hours, then analysis by Flow cytometric. APC signal was used to evaluate the activity.