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人腦是動(dòng)物界中最高度發(fā)達(dá)的大腦，也是我們身體中最復(fù)雜的器官。由于其獨(dú)特的復(fù)雜性，很難用動(dòng)物系統(tǒng)來模擬人腦的發(fā)育。然而，人腦類器官現(xiàn)在已經(jīng)成功地用于模擬人腦發(fā)育和疾病發(fā)生。人腦類器官培養(yǎng)是一項(xiàng)令人興奮的新技術(shù)，科學(xué)家們基于模擬內(nèi)源性發(fā)育過程，通過將多能干細(xì)胞（PSCs）進(jìn)行誘導(dǎo)分化及自組裝后，在體外重現(xiàn)了人類大腦發(fā)育的進(jìn)程。最近的研究表明，腦類器官可以模擬神經(jīng)發(fā)生的時(shí)空動(dòng)態(tài)、區(qū)域神經(jīng)回路的形成以及膠質(zhì)細(xì)胞整合成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。這一技術(shù)可以幫助我們探索大腦發(fā)育、新陳代謝機(jī)制，并進(jìn)行藥物功效測(cè)試。
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由于人腦類器官的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，本文基于Nature protocols的方案，以背側(cè)(hCS)前腦球體為例，簡(jiǎn)要介紹來源于PSCs的腦類器官培養(yǎng)流程【1】。
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人腦類器官的培養(yǎng)
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1.材料
細(xì)胞：hPSCs或iPSCs細(xì)胞
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2.主要培養(yǎng)基
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基礎(chǔ)培養(yǎng)基（主要成分：20% KSR，1% NEAA，0.5% GlutaMAX，0.1mM 2-Mercaptoethanol，10 ng/ml FGF2）；
神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（主要成分：20% KSR，1% NEAA，0.5% GlutaMAX，0.1mM 2-Mercaptoethanol，5μM DM，10μM SB，10μM Y-27632）；
神經(jīng)分化培養(yǎng)基（主要成分：2% B27，1% GlutaMAX，20 ng/ml hEGF，20 ng/ml hFGF2，20 ng/ml hBDNF，20 ng/ml hNT3）
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3.實(shí)驗(yàn)步驟
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1.在涂有基質(zhì)膠的平板上接種hPSCs或iPSCs細(xì)胞，并添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，至出現(xiàn)明顯細(xì)胞團(tuán)；
2.將30-50個(gè)細(xì)胞團(tuán)輕輕重懸于12 ml神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至10cm超低附著平板，將這一天記為第0天。將平板放在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。
3.接下來用12 ml神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(不含Y-27632)培養(yǎng)72小時(shí)；
4.從第6天開始，使用添加了20 ng/ml FGF2和20 ng/ml EGF的神經(jīng)分化培養(yǎng)基，
5.從第12天到第15天，繼續(xù)每天用添加20 ng/ml hFGF2和20 ng/ml hEGF的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
6.從第16天開始，繼續(xù)使用添加了20 ng/ml FGF2和20 ng/ml EGF的神經(jīng)分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每隔一天換液一次，直到第25天。
7.從第25天到第43天，用20 ng/ml BDNF和20 ng/ml NT3替換神經(jīng)分化培養(yǎng)基中的FGF2和EGF，每隔2-3天換液一次。
8.從第43天開始，每隔4天用17-18ml不含生長(zhǎng)因子的神經(jīng)分化培養(yǎng)基換液。在正確操作下，所生成的hCS球體可在培養(yǎng)中維持培養(yǎng)數(shù)月。
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圖1. 體外培養(yǎng)背側(cè)(hCS)前腦類器官的時(shí)間線【1】
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人腦類器官的應(yīng)用
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在過去的幾年中，腦類器官系統(tǒng)已被廣泛用于研究人類大腦疾病。由于腦類器官經(jīng)歷的培養(yǎng)與人類胎兒大腦的發(fā)育步驟相似，所以它們適用于模擬具有實(shí)際病因的神經(jīng)發(fā)育障礙；同時(shí)，通過模擬腦類疾病的進(jìn)展，可以實(shí)現(xiàn)藥物的篩選。
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根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，約5%的世界人口患有神經(jīng)發(fā)育障礙。明確神經(jīng)發(fā)育障礙的原因，并建立適當(dāng)?shù)呐R床前模型，對(duì)于開發(fā)新的治療方法是非常重要的。小頭畸形癥就是使用腦類器官模擬腦部疾病的早期例子。小頭癥腦類器官來源于一名小頭癥患者的iPSCs，該患者在CDK5調(diào)節(jié)亞單位相關(guān)蛋白2(CDK5RAP2)存在突變，這被假定為小頭癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。與對(duì)照組類器官相比，患者源性類器官中的極化神經(jīng)前體細(xì)胞增殖減少、分化提前；此外，對(duì)照組類器官中CDK5RAP2的敲除導(dǎo)致了類似的表型，這表明CDK5RAP2功能的喪失是人類小頭畸形癥的病因之一【2】。這項(xiàng)研究是第一個(gè)使用腦類器官來模擬神經(jīng)發(fā)育障礙的例子，并通過CRISPR/Cas9技術(shù)將腦類器官進(jìn)行基因編輯，為人類了解腦類疾病的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
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人類腦類器官模型同樣為研究感染病的發(fā)病機(jī)制提供了生理學(xué)相關(guān)的平臺(tái)。在ZIKV病毒肆虐期間，有人提出包括小頭畸形在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病可能與ZIKV病毒之間存在聯(lián)系。盡管當(dāng)時(shí)可以在小頭畸形胎兒組織中檢測(cè)到ZIKV病毒，但ZIKV可能損害大腦發(fā)育的機(jī)制仍不清楚。因此許多研究使用了3D腦類器官模型，揭示了ZIKV感染對(duì)人腦發(fā)育的影響【3】。
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大腦類器官技術(shù)的歷史較短，仍處于起步階段。就細(xì)胞和分子組成而言，目前用于產(chǎn)生類腦器官的方案可以模仿妊娠中期左右的人類胎兒的大腦結(jié)構(gòu)。由于類腦器官?zèng)]有帶血管的循環(huán)系統(tǒng)，所以它主要依靠來自培養(yǎng)基的簡(jiǎn)單擴(kuò)散來供應(yīng)氣體和營(yíng)養(yǎng)。當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，由于缺乏氧氣和營(yíng)養(yǎng)，類器官中的大量細(xì)胞發(fā)生凋亡。2019年，WIMMER等人成功培養(yǎng)出了包含內(nèi)皮細(xì)胞和外膜細(xì)胞的人類血管類器官【4】。未來的人腦類器官技術(shù)可以與血管類器官結(jié)合在一起，建立一個(gè)功能性的封閉循環(huán)系統(tǒng)，用以支持類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)，并研究神經(jīng)和血管的相互作用。
※Zhu團(tuán)隊(duì)利用近岸蛋白（Novoprotein）生產(chǎn)的bFGF因子（4ng/ml），成功培養(yǎng)出了人腦類器官，經(jīng)免疫組化檢測(cè)，PAX2（早期發(fā)育的前腦、中腦和后腦標(biāo)記物）和PAX6（前腦標(biāo)記物）均有明顯表達(dá)。并以此作為模型，深入研究了酒精對(duì)人腦類器官神經(jīng)發(fā)生的損害，相關(guān)結(jié)果已于2017年發(fā)表在Lab on a Chip【5】和 Integrative Biology【6】。
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圖2. PAX2（早期發(fā)育的前腦、中腦和后腦標(biāo)記物）和PAX6（前腦標(biāo)記物）均有明顯表達(dá)【6】
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推薦產(chǎn)品-腦類器官培養(yǎng)：
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相關(guān)產(chǎn)品：
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參考文獻(xiàn)
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【1】Sloan, S. A. et al. (2018). Generation and assembly of human brain region–specific three-dimensional cultures. Nature protocols, 13(9), 2062-2085.
【2】LANCASTER, Madeline A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature, 2013, 501.7467: 373-379.
【3】DANG, Jason, et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell stem cell, 2016, 19.2: 258-265.
【4】WIMMER, Reiner A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature, 2019, 565.7740: 505-510.
【5】Zhu, Y. et al. (2017). In situ generation of human brain organoids on a micropillar array. Lab on a Chip, 17(17), 2941-2950.
【6】Zhu, Y. et al. (2017). Probing impaired neurogenesis in human brain organoids exposed to alcohol. Integrative Biology, 9(12), 968-978.
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蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應(yīng)用解決方案的高新技術(shù)企業(yè)，主營(yíng)業(yè)務(wù)為靶點(diǎn)及細(xì)胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發(fā)、生產(chǎn)和銷售，并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)。公司定位為醫(yī)療健康與生命科學(xué)領(lǐng)域原料與技術(shù)解決方案的上游供應(yīng)商，致力于為下游客戶提供及時(shí)、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品及服務(wù)，助力全球生物醫(yī)藥企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)的技術(shù)與產(chǎn)品創(chuàng)新升級(jí)。
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