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人腦是動物界中最高度發達的大腦，也是我們身體中最復雜的器官。由于其獨特的復雜性，很難用動物系統來模擬人腦的發育。然而，人腦類器官現在已經成功地用于模擬人腦發育和疾病發生。人腦類器官培養是一項令人興奮的新技術，科學家們基于模擬內源性發育過程，通過將多能干細胞（PSCs）進行誘導分化及自組裝后，在體外重現了人類大腦發育的進程。最近的研究表明，腦類器官可以模擬神經發生的時空動態、區域神經回路的形成以及膠質細胞整合成神經網絡。這一技術可以幫助我們探索大腦發育、新陳代謝機制，并進行藥物功效測試。
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由于人腦類器官的結構復雜，本文基于Nature protocols的方案，以背側(hCS)前腦球體為例，簡要介紹來源于PSCs的腦類器官培養流程【1】。
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人腦類器官的培養
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1.材料
細胞：hPSCs或iPSCs細胞
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2.主要培養基
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基礎培養基（主要成分：20% KSR，1% NEAA，0.5% GlutaMAX，0.1mM 2-Mercaptoethanol，10 ng/ml FGF2）；
神經誘導培養基（主要成分：20% KSR，1% NEAA，0.5% GlutaMAX，0.1mM 2-Mercaptoethanol，5μM DM，10μM SB，10μM Y-27632）；
神經分化培養基（主要成分：2% B27，1% GlutaMAX，20 ng/ml hEGF，20 ng/ml hFGF2，20 ng/ml hBDNF，20 ng/ml hNT3）
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3.實驗步驟
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1.在涂有基質膠的平板上接種hPSCs或iPSCs細胞，并添加基礎培養基進行培養，至出現明顯細胞團；
2.將30-50個細胞團輕輕重懸于12 ml神經誘導培養基中，轉移至10cm超低附著平板，將這一天記為第0天。將平板放在37℃、5%CO2的培養箱中孵育48小時。
3.接下來用12 ml神經誘導培養基(不含Y-27632)培養72小時；
4.從第6天開始，使用添加了20 ng/ml FGF2和20 ng/ml EGF的神經分化培養基，
5.從第12天到第15天，繼續每天用添加20 ng/ml hFGF2和20 ng/ml hEGF的神經誘導培養基進行培養。
6.從第16天開始，繼續使用添加了20 ng/ml FGF2和20 ng/ml EGF的神經分化培養基進行培養，每隔一天換液一次，直到第25天。
7.從第25天到第43天，用20 ng/ml BDNF和20 ng/ml NT3替換神經分化培養基中的FGF2和EGF，每隔2-3天換液一次。
8.從第43天開始，每隔4天用17-18ml不含生長因子的神經分化培養基換液。在正確操作下，所生成的hCS球體可在培養中維持培養數月。
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圖1. 體外培養背側(hCS)前腦類器官的時間線【1】
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人腦類器官的應用
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在過去的幾年中，腦類器官系統已被廣泛用于研究人類大腦疾病。由于腦類器官經歷的培養與人類胎兒大腦的發育步驟相似，所以它們適用于模擬具有實際病因的神經發育障礙；同時，通過模擬腦類疾病的進展，可以實現藥物的篩選。
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根據統計數據，約5%的世界人口患有神經發育障礙。明確神經發育障礙的原因，并建立適當的臨床前模型，對于開發新的治療方法是非常重要的。小頭畸形癥就是使用腦類器官模擬腦部疾病的早期例子。小頭癥腦類器官來源于一名小頭癥患者的iPSCs，該患者在CDK5調節亞單位相關蛋白2(CDK5RAP2)存在突變，這被假定為小頭癥的風險因素。與對照組類器官相比，患者源性類器官中的極化神經前體細胞增殖減少、分化提前；此外，對照組類器官中CDK5RAP2的敲除導致了類似的表型，這表明CDK5RAP2功能的喪失是人類小頭畸形癥的病因之一【2】。這項研究是第一個使用腦類器官來模擬神經發育障礙的例子，并通過CRISPR/Cas9技術將腦類器官進行基因編輯，為人類了解腦類疾病的機制奠定了基礎。
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人類腦類器官模型同樣為研究感染病的發病機制提供了生理學相關的平臺。在ZIKV病毒肆虐期間，有人提出包括小頭畸形在內的神經系統疾病可能與ZIKV病毒之間存在聯系。盡管當時可以在小頭畸形胎兒組織中檢測到ZIKV病毒，但ZIKV可能損害大腦發育的機制仍不清楚。因此許多研究使用了3D腦類器官模型，揭示了ZIKV感染對人腦發育的影響【3】。
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大腦類器官技術的歷史較短，仍處于起步階段。就細胞和分子組成而言，目前用于產生類腦器官的方案可以模仿妊娠中期左右的人類胎兒的大腦結構。由于類腦器官沒有帶血管的循環系統，所以它主要依靠來自培養基的簡單擴散來供應氣體和營養。當長時間培養時，由于缺乏氧氣和營養，類器官中的大量細胞發生凋亡。2019年，WIMMER等人成功培養出了包含內皮細胞和外膜細胞的人類血管類器官【4】。未來的人腦類器官技術可以與血管類器官結合在一起，建立一個功能性的封閉循環系統，用以支持類器官的長期培養，并研究神經和血管的相互作用。
※Zhu團隊利用近岸蛋白（Novoprotein）生產的bFGF因子（4ng/ml），成功培養出了人腦類器官，經免疫組化檢測，PAX2（早期發育的前腦、中腦和后腦標記物）和PAX6（前腦標記物）均有明顯表達。并以此作為模型，深入研究了酒精對人腦類器官神經發生的損害，相關結果已于2017年發表在Lab on a Chip【5】和 Integrative Biology【6】。
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圖2. PAX2（早期發育的前腦、中腦和后腦標記物）和PAX6（前腦標記物）均有明顯表達【6】
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參考文獻
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【1】Sloan, S. A. et al. (2018). Generation and assembly of human brain region–specific three-dimensional cultures. Nature protocols, 13(9), 2062-2085.
【2】LANCASTER, Madeline A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature, 2013, 501.7467: 373-379.
【3】DANG, Jason, et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell stem cell, 2016, 19.2: 258-265.
【4】WIMMER, Reiner A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature, 2019, 565.7740: 505-510.
【5】Zhu, Y. et al. (2017). In situ generation of human brain organoids on a micropillar array. Lab on a Chip, 17(17), 2941-2950.
【6】Zhu, Y. et al. (2017). Probing impaired neurogenesis in human brain organoids exposed to alcohol. Integrative Biology, 9(12), 968-978.
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蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司，是一家專注于重組蛋白應用解決方案的高新技術企業，主營業務為靶點及細胞因子類蛋白、重組抗體、酶及試劑的研發、生產和銷售，并提供相關技術服務。公司定位為醫療健康與生命科學領域原料與技術解決方案的上游供應商，致力于為下游客戶提供及時、穩定、優質的產品及服務，助力全球生物醫藥企業和研究機構的技術與產品創新升級。
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