誘導多能干細胞（iPSC）和胚胎干細胞（ESC）均具備向多種神經元、膠質細胞分化的潛能，可用于神經退行性疾病相關研究。神經分化體系均包含多步誘導流程，通過模擬胚胎體內天然生理發育過程實現細胞定向特化；常規操作中，向培養體系添加各類信號分子與生長因子，可誘導ESC、iPSC形成具有典型神經玫瑰花環結構的神經前體細胞（NPC）[1]。借助不同分化方案，該類神經前體細胞可進一步定向分化為多種特異性神經元，包括皮層神經元、運動神經元、多巴胺能神經元、膽堿能神經元、谷氨酸能神經元、γ-氨基丁酸能神經元、5-羥色胺能神經元，以及星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞等各類膠質細胞[2]。
本文中將向各位讀者分享iPSC誘導多巴胺能神經元的基本技術路線、誘導方案及關鍵細胞因子介紹。
圖一：Neuronal differentiation from iPSCs[2]
iPSC神經定向分化機制
iPSC向功能性神經細胞（重點為中腦多巴胺能神經前體細胞）分化的基礎邏輯為模擬人體胚胎中腦腹側神經發育時序，通過調控經典信號通路的激活與抑制，實現細胞命運的定向鎖定，主要調控通路包含：SMAD信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、SHH信號通路、FGF家族信號通路[2]。該類通路的動態調控依托小分子抑制劑/激動劑與重組模式化細胞因子組成的雞尾酒誘導體系完成，同步調控多條通路的信號強度與作用時長，精準復刻胚胎發育信號微環境[2]。
圖二：iPSC定向分化多巴胺能神經元技術路線圖[3]
基于現行主流技術路線，可將上述分化技術路線劃分為以下四大標準化階段，具體內容如下：
階段1：多能干細胞穩態維持
本階段旨在維持iPSC多能性、保證細胞活性，為后續分化提供穩定的細胞基礎，避免細胞凋亡、分化異常。
階段2：雙重SMAD抑制介導神經外胚層誘導
本階段目標為阻斷iPSC多能性通路，阻斷中胚層、內胚層分化潛能，定向誘導細胞向神經外胚層轉化，獲得原始神經祖細胞。
雙重SMAD抑制策略是誘導iPSC定向分化為多巴胺能神經元的經典方案[4]，該體系常用抑制劑包含重組蛋白Noggin（Cat.No.:GMP-CB89）與小分子化合物SB431542。Noggin能夠拮抗內源性BMP信號，在分化階段阻斷細胞向滋養層譜系偏移[5]；SB431542特異性阻斷TGF-β通路，通過抑制下游SMAD信號傳導，顯著提升多巴胺能神經元誘導效率[4]。二者聯用具備顯著協同作用，先將iPSC分化為神經前體細胞，再由神經前體細胞衍生出多種神經細胞亞型[4]。
階段3：中腦腹側神經元定向分化
本階段通過激活SHH與FGF8信號通路，將泛神經祖細胞進一步定向誘導為具備特異性分化潛能的中腦腹側底板祖細胞，該類細胞作為多巴胺能神經元的特異性前體細胞，直接決定后續神經元的功能表型與譜系特征。研究表明，聯合激活Wnt與SHH信號通路可有效誘導產生具有多巴胺能分化潛能的底板神經前體細胞，該類前體細胞可進一步特化為成熟多巴胺能神經元[2,6]。其中，rhWnt3a（Cat.No.:GMP-C22R）、rhSHH (Cat.No.:C089)等重組蛋白或小分子化合物可分別或協同激活Wnt與SHH信號通路，顯著促進底板前體生成并推動多巴胺能神經元的定向分化進程[6]。
階段4：神經前體細胞擴增、成熟與功能穩定
本階段旨在實現多巴胺能神經前體細胞的穩定擴增，促進細胞成熟，獲得具備多巴胺合成潛能、可用于移植及實驗的功能性前體細胞。
底板前體細胞形成后，可在分化后期聯用多種小分子與細胞因子，定向誘導iPSC來源神經球、神經前體細胞（NPC）向多巴胺能神經元譜系分化，常用組分包含BDNF（Cat.No.:GMP-C076）、GDNF（Cat.No.:GMP-C226）、TGF-β3（Cat.No.:CJ44）、抗壞血酸及上調胞內cAMP水平的試劑等[6]。其中BDNF、GDNF、TGF-β3均為調控神經元發育、分化與突觸形成的關鍵因子：BDNF可調控細胞蛋白合成、神經元增殖及樹突成熟，該因子信號通路異常與多種神經系統疾病密切相關[7]；GDNF特異性調控多巴胺能神經元的發育、存活與突觸功能構建[7]；TGF-β3是保障多巴胺能神經元正常生長的必要條件，若該因子表達不足，神經元增殖能力可降低3～5倍[8]。
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參考文獻
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